利用海带配子体营养增殖体系实现外源基因表达

IOCAS-IR > 海洋环流与波动重点实验室

	利用海带配子体营养增殖体系实现外源基因表达
	张亦陈
学位类型	博士
	2005-12-30
学位授予单位	中国科学院海洋研究所
学位授予地点	海洋研究所
关键词	海带（laminaria Japonica）配子体生物反应器草丁膦 Bar基因 Egfp（增强型绿色荧光蛋白基因） Rt-pa（瑞替普酶重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失突变体基因） Actin（肌动蛋白基因）启动子
摘要	1993年以来，本实验室在借鉴高等植物基因工程原理和方法的基础上，利用海带世代交替生活史，建立了海带遗传转化体系,并申请国家专利PCT/CN03/00534（Trends in Biotechnology, 2005, 23,264-268.）。海带遗传转化体系是建立在基因枪转化海带配子体，经孤雌或受精途径再生幼孢子体后用氯霉素筛选以及海上安全栽培等一系列技术平台上的新型体系。目前该体系已经成功实现报告基因（β-半乳糖甘酶基因，LacZ）和目的基因（乙肝表面抗原基因，HBsAg）在孢子体阶段的稳定表达。由于应用该体系表达目的基因须经过孢子体再生以及海上栽培等阶段，周期较长，因此本论文拟通过以下5方面工作初步建立以配子体营养增殖为基础的新型海带表达体系，并尝试在配子体阶段实现转化、筛选、增殖及产物检测等操作。1)确立针对配子体的选择标记。2)利用光生物反应器增殖配子体。3)拓展新的报告基因种类。4)克隆内源高效启动子。5)利用该体系表达rt-PA基因（编码价格昂贵的特效溶栓药，瑞替普酶）。本论文研究结果为1)升高温度能够显著增强草丁膦的筛选效果，根据敏感性实验统计结果确定了草丁膦作为海带配子体遗传转化选择压力的筛选方案为40mg/l连续处理7d×3次。2)利用室内光生物反应器营养增殖海带配子体技术，经草丁膦筛选，实现了SV40启动子驱动草丁膦抗性基因bar在配子体细胞中的稳定表达。3)采用调整配子体营养生长状态的方法减低背景荧光，从而首次观察到增强型绿色荧光蛋白基因（egfp）在海带配子体细胞中的瞬间表达。4)克隆了海带肌动蛋白基因（actin）的基因组序列，这是褐藻肌动蛋白基因组序列克隆的首次报道，通过染色体步移获得海带actin基因上游约450bp的片段。5)在上述工作基础上，与中国药科大学合作构建了瑞替普酶基因（rt-PA）的海带表达载体，并实现该基因在海带配子体细胞中的稳定表达，产物具有正确的生物学活性，平均表达量达到0.159μg/mg可溶蛋白。这是该基因在植物中表达的首次报道。研究结果提示在光生物反应器营养增殖体系基础上构建海带配子体表达系统的方案是可行的。
页数	113
语种	中文
文献类型	学位论文
条目标识符	http://ir.qdio.ac.cn/handle/337002/1189
专题	海洋环流与波动重点实验室
推荐引用方式 GB/T 7714	张亦陈. 利用海带配子体营养增殖体系实现外源基因表达[D]. 海洋研究所. 中国科学院海洋研究所,2005.

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