栉孔扇贝(Chlamys farreri)Toll样受体及其信号传递相关基因的克隆与表达

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	栉孔扇贝(Chlamys farreri)Toll样受体及其信号传递相关基因的克隆与表达
	邱丽梅
学位类型	博士
	2006-06-10
学位授予单位	中国科学院海洋研究所
学位授予地点	海洋研究所
关键词	栉孔扇贝模式识别受体 Toll样受体 Myd88 Traf6 Cactus 基因克隆 Realtime Pcr
摘要	扇贝是我国海水养殖的重要品种，但自1994年以来，养殖扇贝陆续爆发的大规模死亡，不但造成了巨大的经济损失，而且直接威胁到现有产业的生存和发展。引起扇贝大规模死亡原因是多方面的，其主要原因是养殖环境恶化、扇贝种质衰退和抗病力下降。因此，深入研究扇贝免疫防御机制，探讨提高机体抗病力的有效途径和方法，改良种质和培育抗病品系，无疑是解决目前困扰扇贝养殖业健康可持续发展的必经之路。 Toll样受体（TLRs）家族是新近发现的模式识别受体（PRRs），参与识别病原体相关的分子模式（PAMPs），在天然免疫系统中起着非常重要的作用。哺乳动物中Toll样受体信号通路还参与诱导树枝状细胞成熟、参与免疫耐受、参与凋亡发生发展、介导非感染性因素的识别等，被视为联系天然免疫和获得性免疫的桥梁。同时果蝇的Toll信号通路也是不具备获得性免疫的果蝇赖以抵御病毒、细菌和真菌感染，介导天然免疫反应的重要信号通路。本研究采用大规模EST测序方法，结合Genome Walker库的构建和cDNA末端快速扩增技术，从栉孔扇贝克隆得到CfToll-1、CfMyd88、CfTRAF6和CfCactus这四个Toll样受体信号通路基因的全长cDNA，同时用荧光实时定量PCR技术检测了这些基因的组织分布及在脂多糖（LPS）和肽聚糖（PGN）刺激下的表达规律。栉孔扇贝Toll样受体（CfToll-1）的cDNA序列全长4308 bp，包含5’非翻译区（UTR）211 bp，3597 bp的开放阅读框，500 bp的3’UTR，最后为18个腺嘌呤的ploy A 尾巴。开放阅读框编码1198个氨基酸的多肽，该多肽的估计分子量为137.41kd，估计的等电点为5.62，该多肽有信号肽，具有一个预测的跨膜区，因此是一种跨膜蛋白。经BLAST比对，CfToll-1基因与节肢动物多种Toll蛋白高度的相似性。SMART（Simple Modular Architecture Research Tool）软件分析，CfToll-1包含典型的Toll样受体的结构：富含亮氨酸的重复序列的胞外区（leucine-rich repeats, LRR），一段跨膜结构域，以及胞内区的TIR结构域（Toll/IL-1 receptor homologous region）。利用Real-time RT-PCR发现CfToll-1mRNA在扇贝体内普遍存在于血细胞、肌肉、外套膜、心、性腺和鳃组织中。利用体外培养的原代血细胞系研究不同浓度LPS刺激后CfToll-1的表达变化，结果显示低剂量（100ng.mL-1 ）LPS 使CfToll-1 mRNA表达量减小，该变化在1.5h、3h 和9h组差异显著，虽然在6h组表达量稍有恢复，但尚未达到对照水平；用1μg.mL-1LPS处理细胞时， 6h组CfToll-1表达量明显上调，约为对照水平的2倍。证实细菌结构脂多糖对CfToll-1基因的表达有影响，且这种影响有剂量依赖效应。栉孔扇贝Myd88同源基因（CfMyd88）的cDNA序列全长1554bp，包含5’UTR 427 bp，1101bp的开放阅读框，最后为18个腺嘌呤的ploy A 尾。CfMyd88的开放阅读框可编码367个氨基酸的多肽，该多肽的估计分子量为42.37kD，估计的等电点为5.71。利用SMART程序分析发现CfMyd88编码了Death和TIR结构域, 这两个结构域是Myd88特征结构。BLAST程序发现扇贝的序列与数据库哺乳动物的Myd88基因高度同源。原代培养的扇贝血细胞在受到PGN刺激后，CfMyd88 mRNA表达在1.5小时开始下调，直到9小时下调至对照表达量的1/10，证实肽聚糖结构对CfMyd88基因的表达有影响。栉孔扇贝TRAF6同源基因（CfTRAF6）的cDNA序列全长2510bp，包含5’UTR 337 bp，1965bp的开放阅读框，3’UTR 208bp，最后为21 个腺嘌呤的ploy A 尾巴。CfTRAF6开放阅读框编码655个氨基酸的多肽，该多肽的估计分子量为74.09kD，估计的等电点为6.01。InterPro Scan在线分析发现CfTRAF6有典型的TRAF蛋白家族的特征结构，包括的一个指环结构，两个锌指结构，一个MATH （the meprin and TRAF homology）结构域以及Coiled-coil区域。CfTRAF6的序列与数据库多物种的TRAF6高度同源，同源性最高的是乌贼序列（Identity＝68）和鼠类（Identity＝45%）。利用Real-time RT-PCR，发现CfTRAF6在各组织普遍存在，在性腺中的表达最高。原代培养的扇贝血细胞在受到不同浓度PGN刺激后，与CfMyd88的情况一样，CfTRAF6的表达量变化减少，且这种变化随剂量的增加更加明显。栉孔扇贝Cactus同源基因（CfCactus）的cDNA序列全长2488bp，包含5’UTR 181 bp，840bp的开放阅读框， 3’UTR 1467bp，最后为19个腺嘌呤的ploy A 尾巴。CfCactus的开放阅读框编码279个氨基酸的多肽，该多肽的估计分子量为31.37 kD；估计的等电点为4.74，与果蝇的Cactus基因的等电点相近（4.5）。利用SMART程序分析发现CfCactus主要编码了ANK结构域（ankyrin repeats）。Cactus基因为哺乳动物NF-κB抑制蛋白IκB的同源分子，BLAST 程序发现扇贝的序列与数据库多物种的Cactus或IκB基因高度同源。同源性最高的是太平洋牡蛎（Identity=35%）和圆尾鲎（Identities = 44%）。对CfTCactus mRNA在扇贝的血细胞、性腺、肠的组织表达进行分析，并同时与CfTRAF6和CfMyd88的表达量进行了对比，发现CfCactus的表达水平明显高于这两个基因，而且CfTRAF6的基因表达量也高于CfMyd88，表现出级联放大效应。正常情况下，三个基因在性腺的表达量最高，推测这条通路可能和发育等功能密切相关。通过本研究我们首次在双壳类软体动物找得到与果蝇Toll蛋白家族高度同源的CfToll-1基因，同时发现其他三个在Toll样受体信号传递过程中起重要作用的基因，其中包括在软体动物中获得的第一个Toll样受体的接头分子－CfMyd88基因，该结果直接证明软体动物具有与哺乳动物和节肢动物高度类似Myd88依赖的Toll样受体信号通路。同时通过这些基因组织分布的研究以及细菌结构LPS和PGN对这条通路上基因表达的影响，证明扇贝Toll信号通路可能与在果蝇中一样，参与扇贝的发育和免疫防御等多种功能。
页数	147
语种	中文
文献类型	学位论文
条目标识符	http://ir.qdio.ac.cn/handle/337002/735
专题	海洋环流与波动重点实验室
推荐引用方式 GB/T 7714	邱丽梅. 栉孔扇贝(Chlamys farreri)Toll样受体及其信号传递相关基因的克隆与表达[D]. 海洋研究所. 中国科学院海洋研究所,2006.

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