牙鲆 (Paralichthys olivaceus) FerritinM的克隆、表达及功能的研究

IOCAS-IR > 实验海洋生物学重点实验室

	牙鲆 (Paralichthys olivaceus) FerritinM的克隆、表达及功能的研究
	Wang JJ(王晶晶)
学位类型	硕士
导师	孙黎
	2015-05-24
学位授予单位	中国科学院大学
学位授予地点	北京
学位专业	海洋生物学
关键词	牙鲆铁蛋白络合铁抑菌抗氧化
摘要	在本研究中，我们通过双向电泳技术（2-DE）结合质谱技术（MALDI-TOF MS/MS）对牙鲆感染迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）12h后脾脏中蛋白质的差异表达情况进行了分析，最终鉴定得到了20种表达差异的蛋白，并对细菌感染后上调表达的铁蛋白（Ferritin）进行了深入的研究。铁蛋白是一种进化非常保守的蛋白，在维持机体内铁离子的稳态中起着至关重要的作用。本实验克隆鉴定了牙鲆的一个M型铁蛋白(PoFerM)，并对其基因结构和生物学功能进行了分析。PoFerM由176个氨基酸残基组成，包含了两个保守的结构域：铁氧化酶位点（ferroxidase site）和铁水合位点（ferrihydrite nucleation site）。PoFerM的5’-UTR含有一个保守的茎环结构，即铁反应元件（iron response element, IRE），是铁蛋白表达的主要调控因子。正常生理条件下，PoFerM在牙鲆多个组织内都有表达，其中在血液中表达量最高。感染细菌后，PoFerM在头肾、脾和肝中的表达都显著上调。重组PoFerM蛋白(rPoFerM)表现出络合铁的能力和明显的抑菌能力。对PoFerM的铁氧化酶位点和铁水合位点的两个关键氨基酸进行突变，得到重组的突变蛋白rPoFerMM。rPoFerMM没有明显的铁络合能力和抑菌能力。研究还发现rPoFerM可以减少芬顿反应产生的羟基自由基对质粒DNA和牙鲆PBL细胞的氧化损伤，而rPoFerMM则没有这种能力。此外，相比表达rPoFerMM的大肠杆菌和正常的大肠杆菌，表达rPoFerM的大肠杆菌表现出更强的过氧化氢能力。这些结果表明PoFerM是一种铁离子螯合剂，并且具有抑菌和抗氧化能力,而这些能力依赖于保守的铁氧化酶位点和铁水合位点。
其他摘要	In this study, two-dimensional electrophoresis (2-DE) combined with mass spectrometry (MALDI-TOF MS/MS) were conducted to examine flounder proteins altered in expression at 12h post Edwardsiella tarda infection. Twenty differentially expressed proteins from spleen of flounder were identified, and one of the upreguleted protein ferritin was deep researched. Ferritin is an evolutionarily conserved protein that plays a vital role in maintaining iron homeostasis. In this study, we identified a ferritin M (PoFerM) from Japanese flounder (Paralichthys olivaceus) and analyzed its biological property. PoFerM is composed of 176 amino acid residues and contains the conserved ferroxidase site and the ferrihydrite nucleation center typical of M ferritins. Expression of PoFerM occurred in multiple tissues and was most abundant in blood. Bacterial infection upregulated PoFerM expression in head kidney, spleen, and liver in a time-dependent manner. Recombinant PoFerM (rPoFerM) purified from Escherichia coli exhibited iron-chelating activity and inhibited bacterial growth, whereas rPoFerMM, the mutant protein that bears alanine substitution at two conserved residues of the ferroxidase center and the ferrihydrite nucleation center, failed to do so. Oxidative protection analysis showed that rPoFerM, but not rPoFerMM, was able to alleviate the deleterious effect caused by hydroxyl radicals through Fenton-type reactions on plasmid DNA and primary flounder cells. Furthermore, E. coli expressing rPoFerM, but not rPoFerMM, exhibited significantly increased survival capacity upon H2O2 exposure. Together these results indicate that PoFerM is an iron chelator with antimicrobial and antioxidative properties, all which depend on the conserved ferroxidase center and the ferrihydrite nucleation site.
语种	中文
文献类型	学位论文
条目标识符	http://ir.qdio.ac.cn/handle/337002/22795
专题	实验海洋生物学重点实验室
作者单位	中国科学院海洋研究所
第一作者单位	中国科学院海洋研究所
推荐引用方式 GB/T 7714	Wang JJ(王晶晶). 牙鲆 (Paralichthys olivaceus) FerritinM的克隆、表达及功能的研究[D]. 北京. 中国科学院大学,2015.

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牙鲆 (Paralichthys oli（2115KB）	学位论文		限制开放	ODC PDDL	浏览