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多酚及负载多酚的壳聚糖基纳米颗粒对水母蜇伤的疗效评价与机制研究
耿昊
Subtype博士
Thesis Advisor于华华
2024-05-19
Degree Grantor中国科学院大学
Place of Conferral中国科学院海洋研究所
Degree Name理学博士学位
Abstract

水母蜇伤是全球范围沿海地区的公共健康问题,也是最常见的海洋生物伤,对沿岸游客及涉海工作人员的人身安全构成了巨大的威胁。钵水母纲中的沙海蜇(Nemopilema nomurai是世界上最大且最危险的水母之一,广泛分布于我黄、渤海和日本韩国海域。沙海蜇自2002年以来频繁发生大范围的种群暴发增长,引发了所分布海域最广泛和严重的蜇伤病例。被沙海蜇蜇伤后的主要症状为局部皮肤症状,包括红斑丘疹、水肿、疼痛、瘙痒等症状,偶尔有死亡病例。近年来研究人员通过对沙海蜇毒液进行转录组学和蛋白组学等研究发现,金属蛋白酶磷脂酶是其中的主要毒性成分沙海蜇毒素致皮肤损伤的炎症刺激、代谢调控等方面的研究,印证了金属蛋白酶和磷脂酶成分作为水母蜇伤治疗靶点的可行性本文选取了酚类化合物中羟基苯甲酸类、苯丙烯酸类、黄酮以及其他类中的部分化合物,从毒素酶活性、分子对接互作、体内蜇伤模型等多方面分析比较了多酚类化合物对沙海蜇蜇伤的治疗作用。并且基于此结果进一步开发了两类负载多酚的壳聚糖基纳米粒,可溶性大豆多糖-羧化壳聚糖纳米粒和卵磷脂-羧化壳聚糖纳米粒,对形貌特征等进行了表征。通过体内蜇伤模型评价了多种纳米粒对沙海蜇毒素致皮肤损伤的修复能力主要的研究结果如下:

  1. 评价了多种酚类化合物对沙海蜇毒素磷脂酶A2、金属蛋白酶活性、细胞毒性、炎症诱导能力的抑制作用,发现其中羟基苯甲酸类中的原儿茶酸和龙胆酸,羟基苯丙烯酸类中的香豆酸、阿魏酸、咖啡酸、芥子酸和绿原酸,以及黄酮等其他类中的槲皮素、杨梅素、儿茶素、白藜芦醇和水飞蓟素对沙海蜇毒素的抑制效果显著。通过Alphafold预测得到可靠的沙海蜇毒素金属蛋白酶结构模型NnNV-MMP-3和毒素磷脂酶结构模型NnNV-PLA-3,分子对接分析发现两种预测模型与上述酚类化合物存在包括氢键、盐桥、Π-阳离子等在内的多种分子间相互作用关系。
  2. 通过沙海蜇毒素致皮肤损伤动物模型,发现羟基苯甲酸类中的原儿茶酸和龙胆酸,羟基苯丙烯酸类中的香豆酸、阿魏酸、咖啡酸、芥子酸和绿原酸,以及黄酮等其他类中的槲皮素、杨梅素、儿茶素和白藜芦醇均能在不同程度上促进损伤组织的愈合和修复。具体表现在减小伤口宽度,增加真皮层厚度,促进胶原纤维沉积和细胞外基质重塑,使生长因子VEGFbFGF在表皮附近积聚,以及调节毒素诱导的体内炎症。
  3. 制备了可溶性大豆多糖-羧化壳聚糖纳米颗粒和卵磷脂-羧化壳聚糖纳米颗粒,分别对具有蜇伤治疗作用的槲皮素、杨梅素、儿茶素和白藜芦醇进行封装,并基于透皮给药的粒径要求优化制备条件,得到4种可溶性大豆多糖-羧化壳聚糖纳米颗粒,SSPS-CCS-QUESSPS-CCS-MYRSSPS-CCS-CATSSPS-CCS-RES,以及4种卵磷脂-羧化壳聚糖纳米颗粒,LC-CCS-QUELC-CCS-MYRLC-CCS-CATLC-CCS-RES。通过TEMFTIRXRDDSC等表征上述纳米粒,发现其粒径均分布于200 nm以下且呈现为粗糙的球型结构。进一步的活性评价发现SSPS-CCS-QUESSPS-CCS-MYRSSPS-CCS-CATSSPS-CCS-RESLC-CCS-QUELC-CCS-MYRLC-CCS-CATLC-CCS-RES均能在不同程度上对沙海蜇毒素诱导的皮肤损伤起到促进愈合和修复的作用,促进了损伤处胶原纤维沉积和细胞外基质重塑,使生长因子VEGFbFGF在表皮附近大量积聚,同时刺激皮肤损伤处的巨噬细胞向M2型极化。表明多种机制共同参与了对损伤组织的修复。

综上所述,多种酚类化合物以及制备的多种负载多酚壳聚糖基纳米颗粒均对沙海蜇蜇伤具有优异的治疗作用。本论文的研究结果为新型高效水母蜇伤治疗药物的开发提供了新的研究思路。

Other Abstract

Jellyfish stings have become the most common marine envenomation incidents, posing significant risks to individuals engaging in water-related activities in warm seas and coastal residents. Among the classes of jellyfish, the Nemopilema nomurai, found extensively in the Yellow Sea and the Bohai Sea of China as well as Japanese and Korean waters, is one of the largest and most dangerous species. Since 2002, this species has frequently experienced massive population outbreaks, leading to the most extensive and severe envenomation incidents in these regions. The primary symptoms following Nemopilema nomurai sting include local skin reactions such as erythema, papules, edema, pain, and pruritus, with occasional fatalities reported. Recent transcriptomic and proteomic studies on the venom of Nemopilema nomurai have identified metalloproteases and phospholipases as its principal toxic components. Research into the dermonecrotic effects of Nemopilema nomurai nematocysts venom (NnNV) has confirmed the feasibility of targeting these enzymes in developing treatments for jellyfish stings. This study evaluates various phenolic compounds, including hydroxybenzoic acids, hydroxycinnamic acids, flavonoids, and other phenolics, for their therapeutic effects on jellyfish envenomations through assays on enzymatic activity, molecular docking interactions, and in vivo sting models. Furthermore, this thesis develops two types of phenolic-loaded natural chitosan-based nanoparticles: soluble soy polysaccharide-carboxymethyl chitosan nanoparticles and lecithin-carboxymethyl chitosan nanoparticles. The optimization of the nanoparticles' synthesis conditions, characterization of their morphological features, and internal binding actions are detailed. The in vivo model for jellyfish sting injury was used to assess the reparative capabilities of various nanoparticle formulations on skin damages induced by NnNV. The main findings include:

  1. Verification of the inhibitory effects of multiple phenolic compounds on the activities of phospholipase A2 and metalloproteases in NnNV, and their anti-inflammatory and cytotoxic properties. Compounds such as protocatechuic acid and gentisic acid (hydroxybenzoic acids), as well as coumaric acid, ferulic acid, caffeic acid, sinapic acid, and chlorogenic acid (hydroxycinnamic acids), along with flavonoids such as quercetin, myricetin, catechin, resveratrol, and silymarin, showed significant inhibitory effects. 
  2. Through an animal model of skin injury caused by NnNV, it was found that these phenolic compounds facilitated tissue repair and healing to varying degrees, as evidenced by reduced wound width, increased dermal thickness, enhanced deposition of collagen fibers, extracellular matrix remodeling, accumulation of growth factors VEGF and bFGF near the epidermis, and modulation of toxin-induced inflammation.
  3. The creation of soluble soy polysaccharide-carboxymethyl chitosan nanoparticles and lecithin-carboxymethyl chitosan nanoparticles, encapsulating active phenolic compounds, optimized for transdermal drug delivery requirements, demonstrated efficient encapsulation and reparative capabilities against skin injuries induced by NnNV. Both nanoparticle formulations promoted collagen fiber deposition and extracellular matrix remodeling at the injury site, facilitated accumulation of VEGF and bFGF, and stimulated macrophage polarization towards the M2 phenotype, contributing to tissue repair.

In summary, the study elucidates the therapeutic potential of various phenolic compounds and phenolic-loaded chitosan-based nanoparticles in treating jellyfish stings, providing novel insights for the development of effective jellyfish envenomation therapies.

MOST Discipline Catalogue理学 ; 理学::海洋科学
Language中文
Table of Contents

第1章 绪论 1

1.1 水母蜇伤与水母毒素 1

1.1.1 水母蜇伤概况 1

1.1.2 水母毒素成分及毒性分析 4

1.2 水母蜇伤治疗研究进展 8

1.2.1 水母蜇伤急救处理 8

1.2.2 抗水母毒素血清的应用 10

1.2.3 小分子药物的应用 11

1.3 酚类化合物的抗毒素活性 13

1.3.1 酚类化合物的生物活性 13

1.3.2 酚类化合物在治疗动物毒素中毒方面的应用 14

1.4 天然聚合物基纳米材料的发展 15

1.4.1 天然聚合物基纳米材料概况 15

1.4.2 部分天然聚合物基纳米材料在生物医药领域的应用 16

1.5 选题意义与研究内容 17

第2章 酚类化合物对沙海蜇毒素毒性的抑制作用研究 20

2.1 羟基苯甲酸类化合物对沙海蜇毒素毒性的抑制 20

2.1.1 实验材料与仪器 20

2.1.2 实验方法 22

2.1.3 结果与分析 27

2.2 羟基苯丙烯酸类化合物对沙海蜇毒素毒性的抑制 34

2.2.1 实验材料与仪器 34

2.2.2 实验方法 36

2.2.3 结果与分析 37

2.3 黄酮等其他酚类化合物对沙海蜇毒素毒性的抑制 39

2.3.1 实验材料与仪器 39

2.3.2 实验方法 41

2.3.3 结果与分析 41

2.4 沙海蜇毒素酶与酚类化合物互作的生物信息学分析 44

2.4.1 生物信息学方法 44

2.4.2 结果与分析 47

2.5 本章小结 64

第3章 酚类化合物对沙海蜇毒素蜇伤模型的疗效评价 66

3.1 羟基苯甲酸类化合物对沙海蜇毒素致皮肤损伤的治疗作用 66

3.1.1 实验材料与仪器 66

3.1.2 实验方法 68

3.1.3 结果与分析 72

3.2 苯丙烯酸类化合物对沙海蜇毒素致皮肤损伤的治疗作用 77

3.2.1 实验材料与仪器 77

3.2.2 实验方法 78

3.2.3 结果与分析 80

3.3 黄酮等其他酚类化合物对沙海蜇毒素致皮肤损伤的治疗作用 86

3.3.1 实验材料与仪器 86

3.3.2 实验方法 87

3.3.3 结果与分析 88

3.4 本章小结 92

第4章 负载多酚壳聚糖基纳米粒的制备 94

4.1 实验部分 94

4.1.1 实验材料与仪器 94

4.1.2 实验方法 95

4.2 结果与讨论 97

4.2.1 负载多酚可溶性大豆多糖-羧化壳聚糖纳米粒的制备 97

4.2.2 负载多酚卵磷脂-羧化壳聚糖纳米粒的制备 98

4.2.3 扫描电子显微镜分析纳米粒形貌 99

4.2.4 透射电子显微镜分析纳米粒形貌 100

4.2.5 傅立叶变换红外光谱表征纳米粒 102

4.2.6 X射线衍射表征纳米粒 104

4.2.7 差示扫描量热法表征纳米粒 106

4.3 本章小结 108

第5章 负载多酚壳聚糖基纳米粒对沙海蜇蜇伤模型的疗效评价 109

5.1 实验部分 109

5.1.1 实验材料与仪器 109

5.1.2 实验方法 110

5.2 结果与讨论 111

5.2.1 纳米粒对沙海蜇毒素致皮肤损伤的修复 111

5.2.2 H&E染色分析损伤皮肤组织形态差异 113

5.2.3 Masson染色分析损伤皮肤组织胶原沉积 115

5.2.4 天狼星红染色分析损伤皮肤组织胶原分型 117

5.2.5 免疫组织化学分析组织损伤处生长因子分布 119

5.2.6 纳米粒对组织损伤处巨噬细胞分型的影响 121

5.3 本章小结 123

本文结论 125

创新点 127

参考文献 128

致  谢 140

作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与其他相关学术成果 141

Document Type学位论文
Identifierhttp://ir.qdio.ac.cn/handle/337002/185307
Collection实验海洋生物学重点实验室
中国科学院海洋研究所
Recommended Citation
GB/T 7714
耿昊. 多酚及负载多酚的壳聚糖基纳米颗粒对水母蜇伤的疗效评价与机制研究[D]. 中国科学院海洋研究所. 中国科学院大学,2024.
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