IOCAS-IR  > 实验海洋生物学重点实验室
凡纳滨对虾生长基因BAMBI和ALS11的鉴定及其结构和功能研究
牛瑞刚
Subtype硕士
Thesis Advisor张晓军
2024-05-20
Degree Grantor中国科学院大学
Place of Conferral中国科学院海洋研究所
Degree Name生物与医药硕士
Keyword凡纳滨对虾,SNP变异频率,生长基因,RNA干扰,多组学联合分析
Abstract

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)提供了世界上超过70%的虾类总产量, 在海水养殖产业中占有举足轻重的地位。在过去的数十年中,人们做出了大量的 努力来改善凡纳滨对虾的经济性状,包括生长速度、抗病性、耐高温、耐高盐等。 在这些性状中,生长性状的改良一直是对虾选育的重点。对虾体重、体长等生长 性状呈现较高的遗传力,高于人工养殖的陆生动物。在水产动物中,随着高通量 SNP 分型技术的发展,越来越多与经济性状相关的 QTL 和基因被定位和发掘, 然而甲壳动物生长相关基因的鉴定和功能研究较少。 生长性状是复杂的基因网络调控的结果,受到多方面因素影响,本研究通过 筛选生长相关通路上的基因,结合对虾基因组、转录组和重测序数据,获得了一 批生长候选基因。随后在生长速率不同的凡纳滨对虾个体中进行 SNP 位点分析 和验证,鉴定得到两个生长相关候选基因LvBAMBI和LvALS11。我们克隆并分 析了这两个基因的结构、系统发生和表达模式,通过RNA干扰技术敲降了这两 个基因的表达,并分析了敲降后其生长表型及相关基因表达的变化,同时结合转 录组、代谢组数据分析,发现这两个基因通过调控多种生理生化过程来影响对虾 的生长。论文主要研究结果如下: (1)对虾生长性状候选基因筛选。基于基因组和转录组数据,本研究筛选 了可能与生长相关的信号通路包括胰岛素通路、TGF-β通路等在内的10条通路 上的基因共 428 个。通过与对虾基因组比对筛选出有注释的基因 188 个。将这 188 个基因在已有的所有重测序家系(220个个体)SNP数据集中进行比对,统 计各基因上的不同位点的突变频率,筛选出SNP突变频率高(根据异义突变和移 码突变等主要有义突变个数和频率)的基因74个。查找这74个基因的基因组注 释,结合SMART结构域预测、Blast等方法分析其功能,进一步筛选出SNP变 异频率高的基因25个。本研究先在不同生长速率对虾养殖群体的转录组数据中 进行了差异表达分析,筛选到9个在肌肉中存在差异表达的基因,随后按一定的 标准(等位基因频率在0.05-0.95之间)提取了这些基因的SNP位点数据,并分 析了其基因型与表型的关联。同时,选择了上述25个生长候选基因的部分SNP 位点在对虾21253生长差异家系进行了扩增验证。经以上筛选,最终BAMBI和 ALS-like 两个基因被鉴定为生长基因,后续进行基因结构分析和功能验证。 (2)对虾生长基因LvBAMBI和LvALS11的结构和表达分析。本研究从凡纳 滨对虾基因组和转录组数据中筛选出所有被注释为BAMBI和ALS-like的基因序 列,并对目的序列的基因结构、系统发育进行了分析;依据序列的保守结构域和 同其他物种相关序列在发育树上的位置来鉴定各基因;通过多序列比对确定保守氨基酸位点和 motif;预测了转录因子结合位点,从而进一步分析各基因功能; 同时根据两个基因在不同发育阶段、不同蜕皮时期、不同组织中的表达,确定各 自基因的表达模式。最终将这两个基因分别命名为LvBAMBI 和LvALS11。 (3)双链 RNA 活体干扰实验。为了研究这两个基因在对虾生长中的功能, 本研究以养殖阶段的亚成体凡纳滨对虾为实验材料,对LvBAMBI 和LvALS11进 行活体双链 RNA干扰实验。干扰后的实验样品用实时荧光定量 PCR 检测干扰 效率,并进行体重和体长测量。通过对干扰两周后的实验组的生长性状分析发现, dsBAMBI 组的体重增加量和体长增加量均显著低于两个对照组(PBS 组和 dsEGFP 组),其中体重增加量仅为PBS组的68% (p<0.05),为EGFP组的55% (p<0.05),体长增加量为PBS组的78% (p<0.05),为EGFP组的52% (p<0.05)。 同时 dsALS11 组的体重增加量和体长增加量也均低于两个对照组,其中体重增 加量为PBS 组的74% (p<0.05),为 dsEGFP 组的 83% (p<0.05),体长增加量为 PBS 组的84% (p<0.05),为 EGFP 组的 73% (p<0.05)。该结果表明 LvBAMBI 和 LvALS11 均为对虾生长重要相关基因,它们的表达被敲降后对虾生长受到抑制。 (4)生长基因LvBAMBI和LvALS11的作用机制分析。为了进一步研究这两 个基因对对虾生长的调控作用,本研究将干扰后的样品进行了转录组测序和代谢 组分析。通过转录组和代谢组等多组学联合分析结果显示LvBAMBI通过调控脂 代谢和糖代谢来影响对虾生长,其被敲降以后会首先导致脂代谢受阻,进而无法 为机体提供足够的能量,此时会出现增强糖酵解等糖代谢过程来补足这部分能量 的一个代偿机制。从转录组分析结果来看,LvALS11 被敲降以后,差异基因的 KEGG通路富集结果显示,上调的差异基因主要富集到了如糖原合成等糖代谢通 路上,这表明其可能通过调控糖代谢来影响对虾的生长。在糖代谢相关通路上, 本研究发现编码α-淀粉酶(Alpha-amylase)和麦芽糖酶(Maltase-glucoamylase)的 基因表达量显著上调。同时,也发现PCK和UGP2基因表达上调,它们分别在 糖异生途径和糖原生物合成过程中起重要作用。综合上述结果,这两个基因均为 生长促进基因,主要通过调控脂代谢和糖代谢来影响对虾生长。 本研究通过SNP 位点关联生长相关性状的方法寻找和鉴定生长基因,为对 虾生长性状相关基因的筛选和鉴定提供了新的途径,为深入研究甲壳动物生长调 控机制提供了新的线索。此外,通过该方法鉴定到的生长相关基因的 SNP 位点 可以作为分子标记辅助选择育种,为凡纳滨对虾的良种选育提供分子数据支持。

Other Abstract

MOST Discipline Catalogue工学
Language中文
Table of Contents

                                          

1 绪论... 1

1.1 凡纳滨对虾生长相关基因研究现状... 1

1.1.1 凡纳滨对虾简介... 1

1.1.2 高通量测序技术... 2

1.1.3 GWASeQTL定位及反向遗传学方法... 3

1.2 BAMBI研究进展... 5

1.2.1 BAMBITGF-β通路... 5

1.2.2 BAMBIWnt通路... 6

1.2.3 BAMBI基因研究现状... 7

1.3 对虾ALS家族研究进展... 7

1.3.1 ALS结构和功能... 7

1.3.2 ALS的研究进展... 8

1.4 本研究的目的和意义... 9

2 凡纳滨对虾生长性状候选基因的筛选... 11

2.1 材料与方法... 11

2.1.1 对虾重测序数据集建立... 11

2.1.2 实验动物... 11

2.1.3 对虾21253生长家系和生长群体组织取样... 12

2.1.4 主要试剂及实验仪器... 12

2.1.5 实验所需引物序列... 13

2.1.6 生长相关基因筛选和验证过程... 13

2.1.7 统计分析... 14

2.2 结果和分析... 14

2.2.1 对虾生长相关基因筛选及鉴定... 14

2.2.2 SNP位点特异性验证序列提取... 18

2.2.3 对虾生长群体转录组差异表达分析及SNP位点分析... 19

2.2.4 21253家系中的SNP位点验证... 22

2.3 讨论... 23

2.3.1 通过SNP关联生长性状寻找和鉴定生长相关基因... 23

2.3.2 寻找和鉴定凡纳滨对虾生长相关基因的意义... 24

3 凡纳滨对虾生长基因BAMBI结构和功能研究... 25

3.1 材料与方法... 25

3.1.1 实验动物... 25

3.1.2 组织取样... 25

3.1.3 实验仪器、试剂... 25

3.1.4 引物序列... 26

3.1.5 序列鉴定和分析... 26

3.1.6 多序列比对和系统发生树构建... 27

3.1.7 LvBAMBI的基因表达谱分析... 28

3.1.8 LvBAMBI的转录因子结合位点预测... 28

3.1.9 RNA提取和cDNA合成... 28

3.1.10 基因克隆... 28

3.1.11 双链RNAdsRNA)合成和RNA干扰... 29

3.1.12 RNA干扰后的转录组测序... 32

3.1.13 实时荧光定量PCR.. 33

3.1.14 代谢组与脂质组联合分析... 33

3.1.15 统计分析... 34

3.2 实验结果... 34

3.2.1 LvBAMBI序列特征... 34

3.2.2 LvBAMBI的系统发育分析... 36

3.2.3 LvBAMBI的转录因子结合位点预测... 38

3.2.4 LvBAMBI的基因表达模式分析... 38

3.2.5 LvBAMBIRNA干扰... 39

3.2.6 LvBAMBI敲降后的基因表达变化... 40

3.2.7 LvBAMBI敲降后对对虾脂代谢的影响... 45

3.2.8 LvBAMBI敲降后对对虾糖代谢的影响... 46

3.3 讨论... 49

3.3.1 LvBAMBI的结构和表达分析... 49

3.3.2 LvBAMBI对生长的影响... 50

3.3.3 LvBAMBI对糖代谢和脂代谢的影响... 51

3.3.4 本研究的意义... 52

4 凡纳滨对虾生长基因ALS11的鉴定、分类和功能分析... 53

4.1 材料与方法... 53

4.1.1 实验动物... 53

4.1.2 组织取样... 53

4.1.3 主要试剂及实验仪器... 53

4.1.4 实验所需引物... 53

4.1.5 凡纳滨对虾ALS家族基因成员鉴定... 54

4.1.6 ALS家族基因成员多序列比对及系统发生树构建... 54

4.1.7 凡纳滨对虾ALS家族基因结构与保守基序分析... 54

4.1.8 LvALS11的基因表达谱分析... 55

4.1.9 LvALS11的转录因子结合位点预测... 55

4.1.10 RNA提取和cDNA合成... 55

4.1.11 基因克隆... 55

4.1.12 dsRNA合成和RNA干扰... 55

4.2 结果和分析... 55

4.2.1 ALS家族基因序列特征... 55

4.2.2 ALS基因家族分析及鉴定... 56

4.2.3 ALSs的蛋白质三维结构预测... 58

4.2.4 LvALS11的转录因子结合位点预测... 58

4.2.5 LvALS11表达模式分析... 59

4.2.6 LvALS11RNA干扰实验... 60

4.2.7 LvALS11敲降后的基因表达变化... 61

4.3 讨论... 67

4.3.1 LvALS11的功能... 67

4.3.2 LvALS11对生长可能的影响... 67

4.3.3 本研究的意义... 68

5 总结与展望... 69

5.1研究总结... 69

5.2 主要创新点... 69

5.3 存在问题... 70

5.4 研究展望... 70

参考文献... 71

  ... 79

作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与其他相关学术成果... 81

Document Type学位论文
Identifierhttp://ir.qdio.ac.cn/handle/337002/185250
Collection实验海洋生物学重点实验室
中国科学院海洋研究所
Recommended Citation
GB/T 7714
牛瑞刚. 凡纳滨对虾生长基因BAMBI和ALS11的鉴定及其结构和功能研究[D]. 中国科学院海洋研究所. 中国科学院大学,2024.
Files in This Item:
File Name/Size DocType Version Access License
凡纳滨对虾生长基因BAMBI和ALS11(7169KB)学位论文 暂不开放CC BY-NC-SA
Related Services
Recommend this item
Bookmark
Usage statistics
Export to Endnote
Google Scholar
Similar articles in Google Scholar
[牛瑞刚]'s Articles
Baidu academic
Similar articles in Baidu academic
[牛瑞刚]'s Articles
Bing Scholar
Similar articles in Bing Scholar
[牛瑞刚]'s Articles
Terms of Use
No data!
Social Bookmark/Share
All comments (0)
No comment.
 

Items in the repository are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.