实验海洋生物学重点实验室知识库

高密度养殖可以降低养殖占地需求，增加单位面积产量，实现更高的经济效益，因此成为水产养殖领域的共同诉求。然而，养殖密度过高会产生胁迫作用，直接影响鱼类的生长与存活。在此过程中，鱼类如何感知密度胁迫从而导致生长受限乃至死亡，原因尚不明确。鱼类应激皆是建立在对胁迫因子感知的基础上，因此，高密度养殖环境中胁迫因子的鉴别成为解析密度胁迫机制的关键。信息素作为化学信号传递介质，在鱼类繁殖、生长甚至生存等方面具有重要作用。但是，高密度养殖下的化学通讯在很大程度上被忽略。因此，本研究以大菱鲆（Scophthalmus maximus）为研究对象，将信息素作为切入点，通过环境代谢组学、转录组学、基因克隆、ELISA分析等方法筛选大菱鲆密度胁迫潜在信息素，鉴定信息素嗅觉感知受体；探究信息素介导的密度胁迫产生的具体机制，为集约化健康养殖技术的建立提供参考依据。

（1）大菱鲆密度胁迫信息素筛选

本研究设置低密度（LD）、中密度（MD）和高密度（HD）3个处理组，利用不同密度处理下大菱鲆HPI轴、GH/IGF-1信号通路生理响应情况以确定胁迫状态，同时利用高通量非靶向代谢组学技术，筛选不同密度下大菱鲆释放到水环境中的差异代谢物。结果表明：苯乙烯、脯氨酸、黄嘌呤、十六烷基二酸和苯乙胺为MD vs. LD、HD vs. MD和HD vs. LD共有的显著上调差异代谢物（p<0.05）。根据化合物功能分析，苯乙胺被作为首要候选密度胁迫信息素。苯乙胺合成关键基因aadc组织分布表达显示：肝脏中aadc表达显著高出其它组织6倍以上（p<0.05），说明肝脏是苯乙胺主要合成部位。同时，苯乙胺肝脏合成不受密度处理的影响，能持续稳定合成。苯乙胺符合密度胁迫信息素的基本条件，其浓度与养殖密度紧密相关。

（2）大菱鲆苯乙胺嗅觉受体鉴定

克隆获得大菱鲆taar4基因ORF序列，大菱鲆taar4的ORF长度为984bp，编码327个氨基酸。该蛋白拥有7个α螺旋跨膜结构域，为疏水性稳定蛋白，且符合经典的物种进化理论。

利用双萤光素酶报告基因实验，将转染的细胞与不同浓度的苯乙胺（0（CON）、10^-12、10^-9、10^-6、10^-3mol/L）共同孵育激活大菱鲆TAAR4受体。结果表明：当苯乙胺浓度达到10^-9mol/L时，荧光素酶活性与CON差异显著（p<0.05）；随着苯乙胺浓度（10^-6、10^-3mol/L）的升高，荧光素酶活性呈上升趋势，差异极显著（p<0.001），证明苯乙胺与大菱鲆TAAR4互为配-受体，TAAR4与苯乙胺结合反应具有剂量依赖性和痕量效应特点。

（3）苯乙胺介导大菱鲆胁迫应答信号通路研究

本研究设置苯乙胺外源添加急性处理实验，将水环境苯乙胺浓度设定为0（CON）、10⁻⁷（LP）和10⁻⁵（HP）mol/L，暴露大菱鲆于此环境中2d。结果显示：苯乙胺处理组和密度处理组HPI轴（crh、acth）、GH/IGF-1信号通路（gh、igf-1）关键基因表达特征和血液生化指标变化规律（葡萄糖、皮质醇、甘油三酯、T₃）具有高度相似性，外源性添加苯乙胺同样对大菱鲆产生负面影响。大菱鲆苯乙胺梯度处理与养殖密度梯度处理应激生理响应规律高度一致。

肝脏转录组数据分析显示：大菱鲆感知苯乙胺前后差异表达基因显著富集在糖酵解过程（glycolytic process）、HIF-1信号通路（HIF-1 signaling pathway）、内质网蛋白质加工（protein processing in endoplasmic reticulum）、凋亡过程（apoptotic process）等信号通路上。血液生理生化指标验证显示：暴露于苯乙胺环境中导致大菱鲆血液Hb含量显著下降，MetHb含量显著上升，ALT、AKP、LDH的活性显著高于CON组（p<0.05），说明苯乙胺处理后大菱鲆血液携氧能力可能下降使机体缺氧，从而激活肝脏低氧诱导通路。一方面导致机体能量代谢改变，无氧糖酵解和脂质代谢增加，脂肪积累减少，另一方面，肝脏内质网应激，激活UPR反应清理错误折叠蛋白质，消耗大量ATP，可能进一步减少用于生长的能量。此外，过度的内质网应激激活了大菱鲆内源性凋亡途径，导致肝细胞损伤。同时发现随苯乙胺浓度的升高，其介导的下游生理反应强度也随之增强，进一步证明苯乙胺胁迫反应具备剂量依赖性和痕量效应的特点。以上结果表明：随着养殖密度的增加，苯乙胺的积累可能是产生密度胁迫的原因。苯乙胺可视为一种密度胁迫环境信息素。

第1章 绪论

1.1 养殖密度对鱼类的影响

1.1.1 养殖密度对生长的影响

1.1.2 养殖密度对血液的影响

1.1.3 养殖密度对神经内分泌系统的影响

1.2 鱼类信息素的研究进展

1.2.1 鱼类信息素的功能

1.2.2 鱼类信息素化学种类与特征

1.2.3 鱼类信息素识别

1.2.4 信息素鉴定方法

1.3 研究目的及意义

1.4 技术路线

第2章 大菱鲆密度胁迫信息素筛选

2.1 研究背景

2.2 材料与方法

2.2.1 实验材料与实验设计

2.2.2 主要实验材料与仪器

2.2.3 实验样品采集

2.2.4 实时荧光定量PCR分析

2.2.5 血液生化参数的测定

2.2.6 水环境代谢组分析

2.2.7 数据统计

2.3 结果

2.3.1 不同养殖密度对HPI轴的影响

2.3.2 不同养殖密度对GH/IGF-1信号通路的影响

2.3.3 不同养殖密度对血液生化的影响

2.3.4 不同养殖密度下水环境代谢组学OPLS-DA分析

2.3.5 不同养殖密度下水环境差异代谢物筛选

2.3.6 苯乙胺体内合成分布

2.3.7 不同养殖密度对肝脏苯乙胺合成的影响

2.4 讨论

2.5 小结

第3章 大菱鲆苯乙胺嗅觉受体鉴定

3.1 研究背景

3.2 材料与方法

3.2.1 实验材料

3.2.2 主要实验材料与仪器

3.2.3 大菱鲆taar4全长cDNA序列的克隆

3.2.4 taar4-Rho-pcDNA3.1（-）表达载体构建

3.2.5 双萤光素酶报告基因检测

3.2.6 大菱鲆TAAR4生物信息学分析

3.3 结果

3.3.1 大菱鲆taar4克隆

3.3.2 大菱鲆TAAR4蛋白理化性质

3.3.3 大菱鲆TAAR4蛋白序列分析

3.3.4 大菱鲆TAAR4蛋白系统发育树

3.3.5 大菱鲆TAAR4介导的苯乙胺嗅觉感知

3.4 讨论

3.5 小结

第4章 苯乙胺介导大菱鲆胁迫应答信号通路研究

4.1 研究背景

4.2 材料与方法

4.2.1 实验材料与实验设计

4.2.2 主要实验试剂与仪器

4.2.3 实验样品采集

4.2.4 crh、acth、gh、igf-1相对表达量测定

4.2.5 血液生化参数测定

4.2.6 血液中血红蛋白（Hb）和高铁血红蛋白（MetHb）测定

4.2.7 肝脏转录组分析和qRT-PCR验证

4.3 结果

4.3.1 大菱鲆对外源性苯乙胺的生理响应

4.3.2 苯乙胺介导大菱鲆胁迫应答信号通路

4.4 讨论

4.5 小结

第5章 结论与展望

5.1 研究结论

5.2 展望

参考文献

附录  taar4系统发育分析所用物种及基因AC号

致  谢

作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与其他相关学术成果