中国科学院海洋研究所机构知识库

自上世纪中叶以来，受人类工业活动的影响全球气候变化不断加剧，导致全球海水温度持续上升，海洋咸淡差异加剧，呈现“咸变咸、淡变淡”的趋势。潮间带和河口区等近岸的生态系统是受人类活动影响最大的区域，对气候变化更为敏感，温度和盐度等环境因子波动很大，是最严酷的生态环境之一，生活在其中的海洋生物面临更大的选择压力。牡蛎作为潮间带和河口区的代表物种，具有重要的经济和生态价值。但近年来世界范围内的野生种质资源急剧下降，养殖产业也被夏季大规模死亡等现象困扰多年，因此培育高适应性的牡蛎是种质资源保护以及养殖产业的迫切需求。表型可塑性和遗传变异是固着生活的海洋生物应对环境变化的两种重要策略。基因表达作为连接遗传变异和表型可塑性的桥梁，其可塑性的表达对于调控不同适应性的表型的形成具有重要作用。调控基因表达的遗传变异（调控变异）对于表型可塑性的作用通常依赖于环境条件。但是目前对海洋生物中这种遗传与环境互作（G × E）的调控机制还知之甚少。因此我们可以通过解析基因表达的遗传调控机制，来研究G × E的遗传基础。为了挖掘牡蛎环境适应响应中的关键调控变异，预测全球气候变化背景下牡蛎的适应潜力，本研究开展了以下工作：

1. 基于遗传图谱的高温响应关键基因的表达数量性状位点（expression quantitative trait locus，eQTL）连锁定位

长牡蛎（Crassostrea gigas）和福建牡蛎（Crassostrea angulata）分别分布在我国北方和南方海域，是温度适应性存在分化的两个姊妹种，也是研究温度适应分化机制的理想材料体系。本研究在长牡蛎和福建牡蛎的拟回交家系（ZF2-3）中完成。在高温热激（35 ℃；3 h）条件下检测106个子代牡蛎中的21个HSPs等高温响应基因的表达量，利用实验室前期构建的高密度遗传图谱进行基因的eQTL连锁定位。其中19个高温响应基因定位到显著的调控信号，分析得到56个显著eQTL，共包含164个远端调控位点（distant-eQTL SNP，distant-eSNP）。针对得到的关键eSNP，在另一独立群体（ZF2）中进行关联验证，结果进一步证实了3个关键eSNP和相应的靶基因表达之间的显著关联，并推测它们调控其靶基因的反式作用方式（trans-acting），即通过调控候选效应基因（Genes with an eQTL，eGene）的表达来影响靶基因的转录活性。具体来说：distant-eSNP（Marker13973）的下游2 Kb左右的核糖体蛋白（RPL10A）基因与其靶基因（HSPA9）可能存在相互作用关系。两个完全连锁的distant-eSNP（Marker14346-48和Marker14346-85）的上游3 Kb左右是一个核呼吸因子1（NRF1），该蛋白可以结合在靶基因ATG7基因的上游启动子区来调控其表达水平。这三个位点可能是通过影响eGene（RPL10A和NRF1）的转录来进一步调控靶基因的表达（HSPA9和ATG7）。该研究鉴定到的distant-eSNP是牡蛎高温适应的潜在调控位点，并可应用于耐热牡蛎的遗传改良。

2. 基于液相芯片的温盐适应关键基因的全基因组关联分析

（1）液相芯片的开发

近江牡蛎（Crassostrea ariakensis）在我国沿海广泛分布，由于南北海域的温度和盐度差异，南北方的近江群体产生了适应性分化，群体遗传和转录组分析鉴定到一些受选择的基因组区域和温、盐适应的基因。为了搭建可用于研究环境适应调控机制的分型平台，本研究针对上述区域，设计了30 K SNP靶向基因分型的液相芯片。利用生物素标记双链DNA（double-stranded DNA，dsDNA）探针对目标区域进行液相杂交捕获，然后对富集到的目标基因组区域进行高深度测序并提取目标位点分型。利用该平台对655个近江牡蛎样品进行基因分型，最终得到24541个（81.8%）高质量的SNP，这些SNP大部分位于基因间区和调控区，只有7%位于基因编码区，覆盖953个基因，包括100个高温响应基因和348个高盐响应基因。与全基因组重测序获得的基因型相比，74.2%的SNP分型一致性为100%，平均每个样本的分型一致性为97.8%。群体遗传分析将中国沿海8个地点的野生牡蛎划分成三个分化的群体（北方、南方和中部），这与重测序数据分析得到的结果一致。该芯片为近江牡蛎的数量遗传和群体遗传分析等研究提供了有利的支撑。

（2）全基因组关联分析

本研究在上述液相芯片分型的北方驯化2代且养殖在南方环境中的南方近江牡蛎群体（TSG3）中进行，使用实时荧光定量PCR（RT-PCR）技术检测TRAF7等23个温、盐适应基因在256个牡蛎样本中的表达水平，并进行eQTL的全基因组关联分析，以解析基因表达的调控机制。其中8个基因得到了显著的调控信号，共鉴定到1194个eSNP，包括433个近端调控位点（local-eSNP）和722个distant-eSNP。local-eSNP的平均表达变异解释度（expression variation explanation，EVE）是9.95%，显著高于distant-eSNP（9.15%）。其中TRAF7、SLC6A5、GGT和DAP3基因鉴定到了成簇且连锁的local-eSNP和distant-eSNP。其中TRAF7基因关联到一个包含68个local-eSNP的近端连锁不平衡调控模块（local-regulatory LD block）和一个包含20个distant-eSNP的远端连锁不平衡调控模块（distant-regulatory LD block）。在独立群体（南北近江杂交群体NSS）中对关键的eSNP进行了验证，得到了一些可靠的调控位点：TRAF7基因上游1 Kb左右的一个local-eSNP，该位点落在调控区，可能会影响转录因子的结合活性；TRAF7基因的两个distant-eSNP，这两个位点落在FBXL4A基因下游4 Kb左右，可能通过反式调控方式（trans-acting），影响FBXL4基因来调控TRAF7基因的表达水平。

3. 关键调控变异的G × E分析

首先在北方环境中养殖一年的TSG3群体的89个牡蛎样本中进行eQTL关联分析，并与2（2）中南方环境的结果进行比较。结果表明两个环境下的关联分析共同鉴定到11个BAAT和SLC6A5基因的保守的local-eSNP，但没有鉴定到任何保守的distant-eSNP，这提示local-eSNP在不同环境条件下具有高度保守性，而distant-eSNP具有环境特异性。对上述2（2）部分得到的38个关键eSNP和2个保守的标签local-eSNP进行G × E分析，结果表明高比例的eSNP（34个，85%）具有显著的G × E效应。通过构建G、E、G × E的混合线性模型和绘制基因表达反应范式（gene expression reaction norms，即基因型在不同环境中的基因表达模式），鉴定到两种G × E模式：交叉和非平行。其中21个eSNP表现出交叉的G × E模式，19个eSNP呈现非平行的G × E模式。本研究初步揭示了近江牡蛎G × E的遗传调控基础，为了解海洋无脊椎动物对快速变化的海洋环境的适应进化机制和表型反应预测提供了新的思路。

4. CaTRAF7基因的功能和调控机制研究

TRAF7是肿瘤坏死因子受体相关因子家族（TRAF）最后发现的一个基因，前期研究发现近江牡蛎的CaTRAF7基因在南北环境适应中受到强烈选择。为了验证该基因是否响应环境变化，利用南方近江牡蛎分别进行高温（41 ℃）和高盐（60‰）应激，发现CaTRAF7在高温应激8小时后显著上调，24小时达到最高值，但在高盐应激下没有显著变化。为了进一步研究其功能及表达调控机制，首先克隆了CaTRAF7的CDS区和上游2 Kb左右的调控区序列。CDS序列全长2064 bp，编码687个氨基酸，与人类TRAF7蛋白结构相比，缺少锌指结构域，但N端多了一个富含丝氨酸的低复杂性的区域（low complexity region，LCR）。在HEK293T细胞中过表达CaTRAF7后，NF-κB转录活性下降，利用siRNA敲降CaTRAF7后，凋亡相关基因的表达水平降低，说明在近江牡蛎中该基因参与了Caspase介导的细胞凋亡过程。另外利用双荧光素酶报告系统对南方和北方近江牡蛎个体的上游调控区序列的启动子活性进行了检测，结果表明南方近江的启动子活性显著高于北方。且在上游调控区鉴定到一个由15个SNP和7个INDEL构成的高度连锁的近端作用调控模块（local-LD block）。其中4个变异位点与靶向单标记关联分析得到的eSNP非常接近。

综上所述，本研究在牡蛎中从全基因组角度解析了HSPs和TRAF7等温度和盐度适应基因的表达调控机制，鉴定了关键的近端和远端调控位点，初步揭示了G × E的遗传调控基础，并重点研究了CaTRAF7基因的功能和表达调控机制。研究结果可为海洋生物在全球气候变化加剧背景下的适应潜力评估和预测，牡蛎资源修复以及高适应群体的培育提供理论基础。