实验海洋生物学重点实验室知识库

鱼类为适应不同的水域环境进化出多种生殖方式，大多数硬骨鱼营卵生生殖，仅有约2%的硬骨鱼类营胎生生殖。胎生指卵子在体内受精，胚胎依靠与母体进行营养和气体交换来维持正常的生长和发育。由于硬骨鱼类早期发育缺失缪勒氏管，没有输卵管和子宫，因此硬骨鱼类进化出多种体内妊娠的器官或组织结构。许氏平鲉（Black Rockfish, Sebastes schlegelii）是我国具有重要经济价值的海洋硬骨鱼类，其特殊的胎生生殖方式引起了广泛关注，前期研究已揭示滤泡胎盘结构是许氏平鲉母体与胚胎之间的联系纽带，但是滤泡胎盘的组织结构，发生、发育过程及相关调控机制还未得到充分研究。本文研究了许氏平鲉滤泡胎盘组织结构及其发育特征；通过分析卵巢转录组数据筛选了滤泡胎盘内分泌调控、细胞增殖与迁移、血管化等相关信号通路和关键调控基因；探索了gata4在滤泡胎盘形成过程中的调控作用，为滤泡胎盘形成机理与生理功能的深入认知提供参考。主要结果如下：

1、许氏平鲉滤泡胎盘发育特征及细胞鉴定

III期卵巢中间质中可以观察到基质细胞，其细胞边界不清，细胞核大呈卵圆形，细胞质弱嗜碱性，染色不明显，纤维细胞呈现长梭形，细胞核细长且着色深，细胞质少，呈嗜酸性，为成纤维细胞的前体细胞，偶见血管；IV期卵巢间质中纤维细胞数量减少，基质细胞存在于卵巢间质中；V期卵巢间质中出现成纤维细胞，其细胞核较大，呈卵圆形，染色浅，细胞质丰富，细胞边界不明显，偶尔可见巨噬细胞，血管常常出现在卵母细胞连接处，此期毛细血管数量增多、直径增大。

受精后，胚胎外无双层滤泡结构。在卵裂期，胚胎周围快速形成多层折叠的滤泡胎盘，不同层数之间大致平行，其中包含大量呈索链状排列的成纤维细胞、血管及淋巴细胞，成纤维细胞核仁明显，合成分泌大量胶原纤维，血管直径增大且数量丰富，有利于胚胎和母体之间的气体交换。囊胚期滤泡胎盘排列开始变得散乱，结构松散没有明显的排列规律，在胚胎周围可见脂肪细胞、巨噬细胞。原肠胚时期在胚胎附近也可以看到脂肪细胞，滤泡胎盘内的成纤维细胞细胞核形态、大小不均。

2、许氏平鮋滤泡胎盘发育相关信号通路和关键调控基因预测

许氏平鲉受精前后差异表达基因显著富集在细胞外基质受体相互作用（ECM-receptor interaction）、粘着斑（Focal adhesion）、盒转运蛋白（ABC transporters）、细胞黏附分子（Cell adhesion molecules , CAMs）、细胞因子与细胞因子受体相互作用（Cytokine-cytokine receptor interaction）信号通路。在细胞外基质受体相互作用和黏着斑信号通路中富集到了多个层粘连蛋白（laminin）基因家族的成员。从许氏平鲉基因组数据中确定了14个层粘连蛋白基因，这些基因分布于在许氏平鲉的9条染色体上。所有层粘连蛋白基因含有卷曲螺旋（coiled-coil）结构域和表皮生长因子（Epidermal Growth Factor，EGF）结构域。层粘连蛋白α4链（laminin α4 chain，lama4）在V期卵巢表达量最高，囊胚期维持高表达，在原肠胚时期表达量最低，后续胚胎发育过程中又持续升高，层层粘连蛋白α5链（laminin α5 chain，lama5）、层粘连蛋白β4链（laminin β4 chain，lamb4）、层粘连蛋白γ1链（laminin γ1 chain，lamc1）和层粘连蛋白γ3链（laminin γ3 chain，lamc3）在许氏平鲉不同时期表达量趋势呈抛物线状，在V期卵巢中的的表达量达到峰值。Lama4在成纤维细胞上信号明显，表明成纤维细胞分泌层粘连蛋白组成促进细胞外基质的形成。

3、转录因子gata4在滤泡胎盘发生过程中的表达和调控

将许氏平鲉V期与IV期相比高表达的基因与卵生鱼大菱鲆（Turbot, Scophthalmus maximus）V期高表达基因进行比较，转录因子gata4仅在许氏平鲉V期高表达，推测其与许氏平鲉滤泡胎盘发生发育密切相关。于层粘连蛋白基因家族成员lama4、lama5、层粘连蛋白β2样链（laminin β2 chain-like，lamb2l）和lamc1的启动子区预测到gata4的结合位点，细胞外基质的形成可能受到gata4的调控。从许氏平鲉基因组中鉴定的gata4基因长度为1149bp，编码374个氨基酸。正选择分析结果显示平鲉属gata4存在4个正选择位点，分别为53位的甘氨酸，55位的天冬氨酸，56位的丝氨酸和69位的丝氨酸。V期卵巢内gata4的表达量与III期及IV期相比显著升高，囊胚期及原肠期维持高表达水平，胚胎发育后期其表达量降低。许氏平鲉卵巢组织块gata4过表达后，卵巢内血管生成（vascular endothelial growth factor a, vegfa、angiopoietin Like 1, Angptl1）、细胞增殖生长（insulin like growth factor binding protein 3, igfbp3、wnt family member 11, wnt11）相关基因表达量相对于对照组显著升高。Gata4通过促进细胞增殖、血管形成等生物学过程进而促进许氏平鲉滤泡胎盘的形成。

第1章 引言... 1

1.1 硬骨鱼类繁殖策略多样性... 1

1.2 硬骨鱼胎盘结构、进化及关键调控基因... 2

1.2.1 硬骨鱼类胎盘结构及组织特征... 2

1.2.2 硬骨鱼胎盘进化... 5

1.2.3 硬骨鱼胎盘发育相关基因鉴定及功能分析... 6

1.3 许氏平鲉卵巢、滤泡胎盘发育及功能相关基因... 8

1.4 研究目的及意义... 9

第2章 许氏平鲉滤泡胎盘组织结构与发育特征研究... 11

2.1 研究背景... 11

2.2 材料与方法... 11

2.2.1 样品采集与保存... 11

2.2.2 石蜡切片的制备、染色与观察... 12

2.2.3 RNA提取和反转录... 12

2.2.4 Vimentin原位杂交标记成纤维细胞试验... 12

2.3 结果... 13

2.3.1 许氏平鲉滤泡胎盘发育过程... 13

2.3.2 许氏平鲉滤泡胎盘成纤维细胞鉴定... 17

2.4 讨论... 18

第3章 许氏平鮋滤泡胎盘发育相关信号通路和关键调控基因预测... 21

3.1 研究背景... 21

3.2 材料与方法... 22

3.2.1 样品采集与保存... 22

3.2.2 许氏平鲉滤泡胎盘发生发育相关信号通路和关键基因筛选... 22

3.3 结果... 23

3.3.1 测序数据筛选和组装... 23

3.3.2 许氏平鲉不同卵巢发育期差异基因（DEGs）分析... 23

3.3.3 许氏平鲉及大菱鲆V期与IV期卵巢转录组差异基因筛选及比较分析... 26

3.4 讨论... 30

第4章 laminin基因家族及转录因子gata4在滤泡胎盘发生过程中的表达和调控... 33

4.1 研究背景... 33

4.2 材料与方法... 34

4.2.1 Laminin基因家族鉴定及分析... 34

4.2.2 Gata4在许氏平鲉滤泡胎盘发生过程中的作用验证... 36

4.3 结果... 41

4.3.1 层粘连蛋白基因家族成员的鉴定及作用分析... 41

4.3.2 Gata4在滤泡胎盘发生过程的表达规律及调控作用... 49

4.4 讨论... 56

第5章 结论与展望... 59

5.1 研究结论... 59

5.2 展望... 60

参考文献... 61

附录一  Laminin基因鉴定及发育分析所用基因名称及AC号... 71

附录二  Gata4系统发育分析和进化分析所用物种及基因AC号... 75

致  谢... 77

作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与其他相关学术成果    79