海洋生态与环境科学重点实验室知识库

海参是全球海水养殖产业的重要经济物种，被誉为“海产八珍”之一。海参的营养价值丰富，具有药食同源的特性，并且在维持近海生态系统平衡中发挥着重要的生态作用。在全球气候变化以及人类捕捞的影响下，野生海参资源面临着枯竭的危机，而仿刺参（Apostichopus japonicus）的野生资源也下降了93%。野生资源的减少以及市场需求的增加，特别是对优质海参的需求，导致了海参养殖产业的迅速扩张。海水增养殖是缓解当前资源枯竭的重要途径，苗种生产是海参增养殖业和野外资源补充的基础环节，工厂化人工培育苗种已成为全球最主要的刺参商品苗种来源，保障亲参的成功繁殖是苗种培育过程的前提。脂质是动物繁殖过程中重要的能量来源，在促进卵母细胞成熟、维持精子活力、保障胚胎发育等方面有重要的生殖功能。尽管研究发现刺参体壁中脂质含量较低，但其在性腺中的生殖功能不可忽视。因此，本研究针对刺参繁殖期的脂代谢特征开展了系列实验。刺参在外形上不具有明显的性别差异，而在生理代谢、免疫能力和生长速率方面的性别差异特征已有报道。由于刺参繁殖期的全部营养物质都来自于外源摄入，因此为了提高养殖生产中的繁育效率，亟待查明雌雄刺参在繁殖期是否具有不同的营养需求。为验证外源脂质是否能够促进雌雄刺参的繁殖，本研究解析了刺参脂质类型和脂代谢是否存在性别差异。同时，激素参与调控脂代谢过程，雌二醇（E₂）作为重要的性激素与能量代谢、氧化应激反应、生殖和脂代谢等过程密切相关。E₂是否能够通过调节刺参脂代谢过程来影响生殖功能仍需深入解析，因此需要明确E₂对雌雄刺参脂代谢的调控机制有何影响特征。综合来看，本研究的思路是以性别和激素为两个切入点，利用RNA–seq、LC–MS/MS、ELISA、生化检测、组织切片等方法系统研究了刺参脂代谢途径及其性别差异特征，以期为揭示刺参生理代谢的性别差异特征提供实践基础，为提高刺参繁育效率提供理论借鉴及数据支撑。

（1）通过研究刺参肠道和性腺的代谢特征，分析了刺参脂代谢是否存在性别差异。利用酸水解法检测了性腺中的总脂含量，结果发现卵巢的总脂含量高于精巢。通过RNA–Seq分析了雌雄刺参性腺和肠道中与脂代谢相关的差异表达基因（DEGs），结果发现卵巢中基因的表达更活跃，进一步对刺参细胞色素P450家族基因（AJCYPs）功能进行了分析发现脂质与激素功能密切相关，某些脂质可作为激素的前体参与性激素合成。利用LC–MS/MS鉴定并分析了卵巢和精巢中的差异代谢物，综合分析雌雄刺参性腺和肠道脂代谢特征发现，雄性肠道中FASN的表达相对于雌性上调，精巢中二十二碳六烯酸（DHA）、二十碳五烯酸（EPA）和花生四烯酸（ARA）等多不饱和脂肪酸（PUFAs）含量高于卵巢，这一结果表明PUFA水平在肠道和性腺中具有组织相关性。雌雄刺参肠道酶活力检测结果表明，胰蛋白酶和脂肪酶活力无显著的性别差异，但淀粉酶活力具有显著的性别差异。因此，刺参肠道和性腺的脂代谢在生理、分子水平均具有性别差异特征。

（2）通过在膳食中添加亚麻酸，分析了雌雄刺参适应高脂饲料时是否具有不同的生理代谢特征，以确定雄性和雌性刺参是否具有不同的脂质营养需求。利用16S rDNA 测序分析了不同脂质水平饲料影响下刺参肠道微生物的差异，结果发现高脂饲料会显著影响肠道微生物的丰度及多样性，补充膳食脂质增强了肠道中变形菌的优势，同时根据其他微生物在肠道中表现出的变化显示这有助于维持肠道稳态。使用LC–MS/MS方法研究了脂代谢途径和相关代谢物的变化，结果发现刺参代谢物的性别差异受膳食脂质的影响，并且通过改变膳食脂质水平，刺参肠道和性腺中的定植环境改变，这可能是导致雄性和雌性刺参肠道微生物发生变化的原因。然而，在高脂饲料组再次发现了PUFA在肠道和性腺中的水平具有显著相关性，这对刺参肠道和性腺具有组织相关性提供了支撑。

（3）通过对类固醇激素进行检测以及外源干扰实验，分析了E₂作为促进刺参性腺发育诱导添加剂的可能性。利用LC–MS/MS方法鉴定了刺参中类固醇激素的种类，分析了刺参性腺发育时期激素含量的动态变化，结果表明雌激素中的雌酮、17α–E₂、17β–E₂含量随着刺参性腺发育而显著性增长，雄激素中睾酮和雄烯二酮的含量随着性腺发育而显著性降低。通过外源添加E₂对处于刺参性腺生长期的刺参进行了干扰，利用ELISA分析了刺参体腔液中E₂的含量，通过投饵量、粪便量以及残饵量计算了实验周期内刺参的日摄食率和消化率，同时对性腺进行了石蜡切片的组织结构观测。结果发现，外源E₂对刺参摄食行为有抑制作用，激素会抑制刺参摄食，降低日摄食率和消化率。外源E₂还能够干扰刺参的生殖行为，但影响程度受浓度的影响，相对低浓度时外源E₂可以促进精子发生以及卵子的成熟，但在相对高浓度情况下雌雄刺参配子的生长则会受到阻碍。因此，外源E₂对刺参的作用效果具有浓度依赖性。

（4）为了进一步研究E₂对刺参脂代谢的调控作用，进行了外源E₂的暴露实验。通过酸水解法检测了刺参肠道和体壁中的总脂含量，分析了E₂和性别对组织总脂的影响，结果发现E₂显著影响雌性肠道和体壁的总脂含量，且会对体壁总脂含量的性别差异产生影响。通过LC–MS/MS进行了刺参肠道中代谢物检测与分析，利用RNA–seq进行了刺参肠道表达基因分析，同时将代谢组和转录组的数据进行了联合分析。结果发现，E₂显著影响脂代谢通路中的基因表达和代谢物水平，雌性刺参中性激素、甘油三酯、脂肪酸代谢更加活跃，雄性刺参的脂肪酸降解及甘油磷脂代谢通路受到干扰。结合体腔液中免疫酶活力及丙二醛含量，系统评价了E₂胁迫下刺参脂代谢通路的变化特征。由于E₂显著抑制了体腔液中过氧化氢酶活力，因此推测E₂是通过诱发雄性刺参氧化失衡引起了脂质代谢异常，而甘油磷脂代谢是E₂在雄性刺参中潜在的靶标通路。

综上所述，本研究以性别和激素为切入点，系统解析了刺参脂代谢途径及其性别差异特征。刺参在总脂、代谢通路、消化酶活力以及肠道微生物方面具有显著的性别差异，鞘脂代谢通路、甘油酯代谢通路、不饱和脂肪酸生物合成代谢是主要的代谢差异通路。由于PUFA水平在性腺和肠道中具有组织相关性，因此刺参肠道代谢对性腺发育具有潜在影响，这为通过改变膳食脂质来提高刺参的性腺发育提供了数据支持。在激素方面，E₂能够影响刺参摄食和生殖行为、改变总脂含量、影响脂代谢通路、干扰免疫酶活性，甘油磷脂代谢是E₂在雄性刺参中潜在的靶标通路。由于E₂对刺参的作用效果具有浓度依赖性，因此适当添加外源E₂能够在代谢稳态前提下促进刺参性腺的发育。

第1章 绪论... 1

1.1 海参繁殖学的研究进展... 1

1.1.1 性别差异特征... 1

1.1.2 刺参的繁殖特征... 2

1.2 脂代谢对繁殖性能的影响... 3

1.2.1 脂质的生理功能... 3

1.2.2 脂代谢的影响因素... 3

1.3 雌激素与脂质的调控关系... 6

1.3.1 雌激素的研究进展... 6

1.3.2 雌二醇在脂代谢的调节作用... 9

1.4 研究目的、意义及研究思路... 9

1.4.1 研究背景与科学问题... 9

1.4.2 研究目的与意义... 10

1.4.3 技术路线... 10

1.4.4 预期成果... 10

1.5 本章小结... 11

第2章 刺参肠道及性腺脂代谢的性别差异... 13

2.1 研究背景... 13

2.2 材料与方法... 14

2.2.1 样品采集与处理... 14

2.2.2 总脂含量检测... 14

2.2.3 表达基因检测与分析... 14

2.2.4 代谢物检测与分析... 16

2.2.5 消化酶活力检测... 17

2.3 实验结果... 17

2.3.1 刺参性腺总脂含量的性别差异... 17

2.3.2 刺参性腺基因表达的性别差异... 18

2.3.3 刺参肠道基因表达的性别差异... 22

2.3.4 刺参性腺代谢物的性别差异... 24

2.3.5 刺参肠道消化酶活力的性别差异... 26

2.4 讨论... 26

2.4.1 刺参性腺和肠道中具有性别差异表达的基因... 26

2.4.2 雌雄刺参的代谢特征及肠道和性腺的组织关联性... 28

2.5 小结... 29

第3章 添加膳食脂质对雌雄刺参脂代谢的影响... 31

3.1 研究背景... 31

3.2 材料与方法... 32

3.2.1 样品采集与暂养... 32

3.2.2 饲料中总脂含量和脂肪酸检测... 32

3.2.3 16S rDNA测序与分析... 33

3.2.4 代谢物检测与分析... 34

3.3 实验结果... 34

3.3.1 饲料的总脂和脂肪酸含量... 34

3.3.2 刺参肠道的微生物群落组成... 34

3.3.3 刺参性腺和肠道的代谢物... 38

3.4 讨论... 42

3.4.1 添加膳食脂质对雌雄刺参肠道微生物的影响... 42

3.4.2 添加膳食脂质对雌雄刺参性腺和肠道代谢物的影响... 43

3.5 小结... 44

第4章 类固醇激素对刺参摄食行为和性腺发育的影响... 45

4.1 研究背景... 45

4.2 材料与方法... 46

4.2.1 样品采集与实验设计... 46

4.2.2 类固醇激素检测与分析... 47

4.2.3 雌二醇检测与分析... 48

4.2.4 粪便及残饵收集... 48

4.2.5 性腺石蜡切片... 49

4.3 实验结果... 49

4.3.1 性腺类固醇激素含量... 49

4.3.2 体腔液雌二醇含量... 52

4.3.3 日摄食率和消化率... 52

4.3.4 性腺组织结构... 53

4.4 讨论... 54

4.4.1 刺参性腺发育期类固醇激素的变化特征... 54

4.4.2 外源雌二醇对刺参行为的影响... 55

4.5 小结... 57

第5章 雌二醇对雌雄刺参脂代谢途径的影响... 59

5.1 研究背景... 59

5.2 材料与方法... 60

5.2.1 实验暂养与样品采集... 60

5.2.2 总脂含量检测... 60

5.2.3 代谢物检测与分析... 60

5.2.4 表达基因检测与分析... 61

5.2.5 免疫酶活力检测... 61

5.3 实验结果... 62

5.3.1 组织中总脂含量... 62

5.3.2 肠道脂代谢通路的变化... 62

5.3.3 免疫酶活力及MDA含量检测... 67

5.4 讨论... 68

5.4.1 雌二醇参与刺参的脂质分解... 68

5.4.2 雌二醇导致的脂代谢异常... 69

5.5 小结... 70

第6章 研究总结与展望... 71

6.1 研究总结... 71

6.2 主要创新点... 72

6.3 存在问题... 72

6.4 研究展望... 72

参考文献... 75

致  谢... 95

作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与其他相关学术成果... 97