中国科学院海洋研究所机构知识库

仿刺参（Apostichopus japonicus），又名刺参，属棘皮动物门（Echinodermata），自然分布于西太平洋北部，是我国重要的海水养殖物种之一，具有非常高的经济价值和营养价值。近年来，受过度捕捞与栖息地被破坏等人为因素和极端环境等自然因素的干扰，我国自然海区的刺参野生种质数量急剧下降，自然资源趋于枯竭，野生刺参已被IUCN红色名录评估为濒危（EN）物种；养殖海参种质退化严重，相继出现了抗逆性差、病害频发、养殖成活率低、养殖周期长、生长速度缓慢等问题，导致商品参质量下降，造成经济损失惨重。因此，刺参的种质资源保护和保存问题亟待解决。超低温冷冻保存技术是当前动物种质保存应用最广泛的方法之一。然而，目前关于刺参精子冷冻保存的研究很少且没有形成统一全面的冷冻保存技术，更不用说将刺参冷冻精子进行商业化、产业化应用。本研究基于程序降温仪和计算机辅助精子分析系统（Computer-assisted sperm analysis，CASA）等精密仪器，对超低温冷冻保存过程中的关键参数进行系统全面的筛选，建立了适用于刺参精子的超低温冷冻保存技术，并建立应用范围更广的刺参精子低温短期保存与超低温冷冻长期保存联用技术；从形态学、生理学、代谢机能和转录组学等多方面研究超低温冷冻保存过程对刺参精子的影响，并建立了通过刺参性状特征参数来预测其精子抗冻能力的回归方程。主要的研究结果如下：

1. 刺参精子超低温冷冻保存技术的建立

在本研究中，通过对稀释剂种类、抗冻剂种类和浓度、降温速率、解冻速率等可能影响经超低温冷冻保存后刺参精子质量的关键参数进行了全面的筛选，建立了适用于刺参精子的超低温冷冻保存技术，并对刺参精子进行超低温冷冻保存的步骤进行了总结。该技术可总结为：（1）使用解剖过滤法采集刺参的新鲜精液并于4 ℃保存备用，吸取少许鲜精用激活剂稀释激活后用CASA系统检测刺参鲜精活力，只有精子活力在85%以上的刺参新鲜精液才能用于精子超低温冷冻保存；（2）以过滤灭菌自然海水（NSW）作为稀释剂，以二甲基亚砜(DMSO)为渗透性抗冻剂，以葡萄糖（Glu）为非渗透性抗冻剂，配制含12.5% DMSO和0.1 mol/L Glu的冷冻保护液，置于4 ℃条件下保存备用；（3）将刺参新鲜精液和冷冻保护液按1:5的稀释比例混合，混匀后立即放入程序降温仪中进行程序性降温过程；（4）降温程序设置为在0 ℃下平衡5 min，然后以10 °C/min的降温速率降温至-80 ℃，在-80 ℃下平衡5分钟后，再以20 ℃/min的降温速率降温至-180 ℃，最后平衡5 min后取出，投入液氮（-196 ℃）中长期保存；（5）待测冻精活力时，将冻存管从液氮中取出，置于20 ℃水浴锅中解冻，轻轻摇动使温度均匀，待管中只剩少量固体时立即取出（约1 min），在空气中继续摇动使其完全融化；（6）立即吸取适量刚解冻的冷冻精液，用激活剂稀释激活后，用CASA系统检测其精子活力。

2. 刺参精子超低温冷冻保存技术在生产应用中的优化

    在本研究中，通过不同冷冻装置和冷冻体积的筛选实验，发现冷冻装置和冷冻体积对刺参冷冻精子活力无显著影响，证明筛选出的刺参精子超低温冷冻保存技术具有大批量保存的应用价值。通过研究不同冷冻保护液配方对刺参精子受精率和孵化率的影响，发现基于最适刺参精子超低温冷冻保存技术获得的刺参冷冻精液的精子活力＞65%，受精率（囊胚期）近80%，孵化率（耳状幼虫早期）＞65%，证明筛选出的刺参精子超低温冷冻保存技术具有一定的生产应用价值。通过筛选实验，首次建立了刺参精子低温保存技术，并建立了应用范围更广的刺参精子低温短期保存与超低温冷冻长期保存联用技术，该技术能使刺参精子在4 d内保持70%以上的精子活力，在10 d内保持50%以上的精子活力，并在短期保存4 d内进行超低温冷冻保存能够获得具有35%以上精子活力的刺参冷冻精子。

3. 超低温冷冻保存过程对刺参精子的影响

    在本研究中，从形态学、生理学、代谢机能和转录组学等多方面研究超低温冷冻保存过程对刺参精子的影响。研究结果表明，超低温冷冻保存过程使刺参的精子活力、精液密度和精子运动速度等生理活性特征指标显著降低，且不同刺参个体的生理活性特征指标降低程度不同；使刺参精子细胞的超微结构遭到头中部破裂、尾部断裂和细胞核、形状不规则等破坏，增加精液中精子的畸形率；使刺参冷冻精液精浆中所检测的所有酶类（包括总 ATP 酶、琥珀酸脱氢酶（SDH）、乳酸脱氢酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT））的活力显著升高，使刺参冷冻精液精子中SOD、SDH和总ATP酶三种酶的活力显著升高，改变精子的代谢过程；使452个基因发生显著下调，162个基因发生显著上调，差异表达基因主要富集到环境应激、代谢抑制和损伤修复等相关通路当中，具体包括“Hippo信号通路”、“逆行内源性大麻素信号通路”、“通过同源重组修复双链断裂”和“通过非同源末端连接修复双链断裂”等通路，表明超低温冷冻保存过程对精子细胞结构及DNA完整性造成一定程度损伤，从而影响其细胞生长及受精能力，同时诱导精子积极启动修复机制。

4. 亲参的性状特征与其精子抗冻能力的相关性

在本研究中，为了能通过刺参的性状特征来预测预测其精子的抗冻能力，对刺参的多个性状特征指标与其冷冻精子的活力做相关性分析。相关性分析结果表明，刺参的总重、皮重、性腺重等表观性状指标和刺参精液的精子活力和精子密度等生理活性特征指标与刺参精子的抗冻能力无显著的相关性关系；刺参新鲜精液精浆中的花生二烯酸相对含量与其精子的抗冻能力存在显著的正向相关性关系；刺参新鲜精液精浆中LDH酶活活性、精子中SOD酶活活性与其精子的抗冻能力存在显著的负向相关性关系，并建立了刺参精浆中LDH和精子中SOD的酶活活性与刺参冷冻精子活力的回归方程，具体为刺参冷冻精子活力（%）=110.093+（-0.367）*精浆中LDH酶活力＋（-0.109）*精浆中SOD酶活力，R²=0.724。