实验海洋生物学重点实验室知识库

不同于由重链和轻链共同组成的传统抗体，软骨鱼类和骆驼科动物体内存在一种天然缺失轻链的重链抗体，分别被命名为IgNAR（Immunoglobulin New Antigen Receptor）和HCAb（Heavy Chain only Antibody）。两种重链抗体的可变区能够重组表达和纯化，又被称为纳米抗体，其中，IgNAR的重链可变区VNAR（Variable domain of Immunoglobulin New Antigen Receptor），大小约12 kDa，是目前已知天然存在最小的抗原结合片段，由于其尺寸小、稳定性好、溶解性高以及原核表达产量高等优点在生物医药各领域被广泛应用。VNAR的免疫法制备历经抗原免疫与滴度监测、纳米抗体文库构建、纳米抗体筛选与制备等环节。纳米抗体文库构建是整个流程中承上启下的步骤，也是最终获得高特异性和高亲和力纳米抗体的关键。本研究聚焦于软骨鱼类纳米抗体开发，以纳米抗体的源头也就是软骨鱼重链抗体IgNAR为出发点，从以下两个方面开展相关研究和应用。

一是开展对软骨鱼重链抗体IgNAR的研究，并将研究结果应用到提高纳米抗体文库多样性中。纳米抗体文库中抗体的多样性是文库构建的基础，对于成功筛选抗体至关重要。但是目前，纳米抗体多样性的研究匮乏，对纳米抗体文库构建造成了阻碍，例如缺少纳米抗体基因座信息，无法获取多基因座来源的纳米抗体，造成构建的文库多样性低。本研究以纳米抗体来源的模式动物——条纹斑竹鲨（Chiloscyllium plagiosum）为研究对象，对其IgNAR基因座进行了鉴定与分析，建立了通过覆盖所有基因座提高纳米抗体文库的多样性的方法；二是开展了纳米抗体来源物种的发掘研究，通过来源生物的多样性来增加纳米抗体文库的多样性。目前，软骨鱼纳米抗体文库的来源动物全部是鲨鱼，而同为软骨鱼，种类更加丰富的鳐鱼的纳米抗体研究未见报道。本研究通过对孔鳐（Okamejei kenojei）重链抗体IgNAR的鉴定，孔鳐VNAR的多样性分析，结构解析以及稳定性检测，确定了孔鳐可以作为软骨鱼纳米抗体的新来源，从源头上丰富了软骨鱼纳米抗体文库的多样性。本研究主要研究结果如下：

1. 鉴定出条纹斑竹鲨IgNAR具有完整重链抗体基因结构的基因座共4个。这4个IgNAR基因座全部位于条纹斑竹鲨44号染色体上，长度范围25.3-33.3 kb根据在染色体上的位置顺序，命名为IgNAR_locus1、IgNAR_locus2、IgNAR_locus3与IgNAR_locus4。其中，IgNAR_locus4位于负链上。通过PCR扩增出4个基因座的转录序列，IgNAR1-IgNAR4。其中IgNAR1、IgNAR2与IgNAR4为全长型（1个可变区，5个恒定区），而且这三种抗体在条纹斑竹鲨血清中也能够通过质谱方法鉴定到，而IgNAR3不具有全长型，仅有两种截短型， IgNAR3_short1（缺失恒定区2和3）与IgNAR3_short2（缺失恒定区1、2和3）。对IgNAR1-IgNAR4的可变区VNAR1-VNAR4胚系基因进行克隆与分析发现，VNAR1-VNAR4胚系基因均含有3个D基因片段。而且除VNAR1外，其余的VNAR均存在V D J胚系连接，其中，VNAR4的胚系连接尤为严重，为“V DDDJ”，即在胚系上3个D与J连接在一起，这种胚系连接方式可能导致VNAR多样性降低，这种假设通过分析VNAR1-VNAR4近百个克隆的氨基酸序列得到验证。
2. 鉴定孔鳐IgNAR及分析孔鳐VNAR多样性。获取了孔鳐血液单个核细胞转录组，并据此检索到孔鳐IgNAR转录本。根据孔鳐IgNAR转录本序列信息克隆到孔鳐IgNAR，结果显示孔鳐具有分泌型与跨膜型IgNAR，且二者都存在两种类型。鉴定出孔鳐具有4个VNAR基因座，V_locus 1-V_locus 4。对孔鳐血液、脾脏与性上器官VNAR多样性的研究结果显示，在严格的多样性分析标准下，每个组织近两百万个VNAR序列中，血液、脾脏与性上器官纳米抗体多样性分别为24827、27137与9574。3个组织VNAR都主要由V_locus 1与V_locus 2编码，二者总使用频率在3个组织中均超过90%。孔鳐VNAR氨基酸变化性分析结果显示CDR3区变化性最高。孔鳐3个组织VNAR近99%都属于Ⅳ型，仅含有1对二硫键，不同于鲨鱼源纳米抗体，为孔鳐纳米抗体独有特征。另外，孔鳐纳米抗体的框架区尺寸与鲨源相似，但是CDR3区域更小，CDR3平均长度约为11个氨基酸残基，小于鲨鱼源的纳米抗体尺寸。
3. 解析孔鳐纳米抗体结构与分析孔鳐纳米抗体的稳定性。表达纯化了4个孔鳐Ⅳ型纳米抗体，VNAR1-VNAR4，并解析了VNAR1的蛋白结构，孔鳐纳米抗体的结构与鲨鱼源纳米抗体结构高度相似，均为框架区形成2个β片层组成结构的主体，CDR/HV形成loop结构聚集在片层一端结合抗原。对4个纳米抗体的稳定性检测结果显示，即使仅有1对二硫键，孔鳐纳米抗体的热稳定性和化学稳定性仍然与具有多对二硫键的鲨鱼源纳米抗体相当。

综上所述，尽管条纹斑竹鲨部分IgNAR基因座存在的VDJ胚系连接可能导致多样性降低，但4个IgNAR基因座还是能够提高纳米抗体多样性，提示在构建条纹斑竹鲨源纳米抗体文库时需要充分扩增出4个IgNAR基因座编码的纳米抗体，以提高纳米抗体文库的多样性。另外，目前软骨鱼纳米抗体研究主要集中在板鳃亚纲侧孔总目的鲨鱼纳米抗体，而鳐鱼等下孔总目软骨鱼纳米抗体研究接近空白，本研究国内外首次鉴定孔鳐存在纳米抗体，且具有更小的分子尺寸、更少二硫键条件下优秀的稳定性等特征，证明其能够作为纳米抗体文库来源的新物种。以上研究结果为软骨鱼类纳米抗体的开发奠定了重要基础。

第1章 绪论 1

1.1  纳米抗体的研究进展 1

1.2  软骨鱼纳米抗体的研究进展 3

1.2.1  软骨鱼纳米抗体的结构特征 3

1.2.2  软骨鱼纳米抗体的多样性特点 6

1.2.3  软骨鱼纳米抗体的应用 7

1.3  纳米抗体文库的研究进展 8

1.4  本研究的研究意义与研究内容 11

第2章 条纹斑竹鲨的免疫与免疫响应的监测 13

2.1  实验材料 13

2.1.1  实验生物 13

2.1.2  实验试剂与耗材 13

2.1.3  实验仪器 14

2.2  实验方法 14

2.2.1  条纹斑竹鲨的饲养 14

2.2.2  条纹斑竹鲨的免疫 15

2.2.3  条纹斑竹鲨免疫响应的检测 16

2.3  实验结果 17

2.3.1  鲨鱼免疫及身体状态监测 17

2.3.2  双夹心ELISA检测鲨鱼免疫响应情况 17

2.4  讨论 18

第3章 条纹斑竹鲨IgNAR基因座的鉴定 19

3.1  实验材料 19

3.1.1  实验生物 19

3.1.2  实验试剂与耗材 19

3.1.3  实验仪器 21

3.2  实验方法 21

3.2.1  条纹斑竹鲨的麻醉 21

3.2.2  条纹斑竹鲨外周血、脾脏与肌肉组织采集 21

3.2.3  条纹斑竹鲨外周血与脾脏单个核细胞分离 22

3.2.4  条纹斑竹鲨外周血与脾脏单个核细胞总RNA提取 23

3.2.5  反转录合成cDNA 23

3.2.6  PCR扩增条纹斑竹鲨IgNAR 24

3.2.7  TA克隆与测序 25

3.2.8  通过BLAST获取条纹斑竹鲨IgNAR基因座信息 26

3.2.9  条纹斑竹鲨不同基因座来源IgNAR的TA克隆及测序 27

3.2.10  条纹斑竹鲨IgNAR的系统发生树分析 28

3.2.11  条纹斑竹鲨血清中IgNAR的鉴定 28

3.2.12  条纹斑竹鲨肌肉组织基因组DNA提取 29

3.2.13  条纹斑竹鲨VNAR胚系基因的TA克隆、测序与分析 30

3.3  实验结果 31

3.3.1  条纹斑竹鲨IgNAR基因座特征与不同基因座来源IgNAR的克隆 31

3.3.2  条纹斑竹鲨IgNAR的系统发生树分析 36

3.3.3  条纹斑竹鲨血清中IgNAR的鉴定 37

3.3.4  条纹斑竹鲨VNAR胚系基因表征 39

3.4  讨论 40

第4章 孔鳐IgNAR的鉴定与纳米抗体多样性分析 43

4.1  实验材料 43

4.1.1  实验生物 43

4.1.2  实验试剂与耗材 43

4.1.3  实验仪器 43

4.2  实验方法 43

4.2.1  孔鳐的麻醉 43

4.2.2  孔鳐外周血、脾脏、性上器官与肌肉组织的采集 43

4.2.3  孔鳐外周血与脾脏单个核细胞分离 43

4.2.4  孔鳐外周血单个核细胞转录组测序 43

4.2.5  通过本地BLAST检索孔鳐IgNAR转录本 44

4.2.6  孔鳐外周血与脾脏单个核细胞，性上器官总RNA提取 44

4.2.7  反转录合成cDNA 44

4.2.8  PCR扩增孔鳐IgNAR 44

4.2.9  TA克隆与测序 45

4.2.10  孔鳐血清中IgNAR的鉴定 45

4.2.11  孔鳐IgNAR系统发生树分析 46

4.2.12  孔鳐肌肉组织基因组DNA提取 46

4.2.13  孔鳐VNAR胚系基因的TA克隆、测序与分析 46

4.2.14  孔鳐外周血、脾脏与性上器官来源VNAR的扩增与纯化 47

4.2.15  高通量测序及VNAR多样性分析 47

4.3  实验结果 48

4.3.1  孔鳐IgNAR转录本的获取 48

4.3.2  孔鳐IgNAR基因的克隆与测序结果 49

4.3.3  孔鳐IgNAR系统发生树分析 52

4.3.4  孔鳐血清中IgNAR的鉴定 53

4.3.5  孔鳐VNAR胚系基因的克隆、测序与分析结果 55

4.3.6  孔鳐外周血、脾脏与性上器官VNAR多样性分析 55

4.4  讨论 59

第5章 孔鳐纳米抗体的结构与稳定性研究 61

5.1  实验材料 61

5.1.1  实验生物 61

5.1.2  实验试剂与耗材 61

5.1.3  实验仪器 63

5.2  实验方法 64

5.2.1  孔鳐纳米抗体的克隆与表达载体的构建 64

5.2.2  孔鳐纳米抗体的诱导表达 65

5.2.3  孔鳐纳米抗体的纯化 66

5.2.4  孔鳐纳米抗体晶体生长条件初筛与优化 68

5.2.5  孔鳐纳米抗体晶体的X射线衍射及数据收集 68

5.2.6  孔鳐纳米抗体晶体结构解析 68

5.2.7  孔鳐纳米抗体热稳定性与化学稳定性的检测 68

5.3  实验结果 69

5.3.1  孔鳐纳米抗体的表达纯化 69

5.3.2  孔鳐纳米抗体VNAR1晶体生长条件初筛与优化 70

5.3.3  孔鳐纳米抗体VNAR1晶体衍射数据收集与结构解析 73

5.3.4  孔鳐纳米抗体的结构特征 75

5.3.5  孔鳐纳米抗体的稳定性 77

5.4  讨论 77

第6章 结论与展望 79

6.1  结论 79

6.2  创新点 79

6.3  展望 80

参考文献 81

附录一  实验动物伦理声明 93

附录二  质谱法鉴定到的条纹斑竹鲨血清中IgNAR的单一肽段 95

致谢 97

作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与其他相关学术成果 99