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真鲷(Pagrus major)和大菱鲆(Scophthalmus maximus)精子介导转基因的初步研究
郑君飘
学位类型硕士
导师李军
2014-05
学位授予单位中国科学院研究生院
学位授予地点北京
学位专业水产养殖
关键词真鲷(pagrus Major) 大菱鲆(scophthalmus Maximus) 精子介导转基因
其他摘要    基因技术是改良生物性状的重要手段,其主要方法包括显微注射、精子介导法、电穿孔等。显微注射在鱼类的应用中存在一些技术难题,一直未有突破性的进展。精子介导法转基因(Sperm-mediated gene transfer,SMGT)操作简便、成本低,同时避开了鱼类受精卵各种特性的限制,在转基因鱼的制备中具有优势。目前鱼类SMGT技术应用仍处于初步阶段,存在不稳定,重复性差等问题,不同鱼种需要针对性地研究具体的精子介导方式和处理条件。真鲷(Pagrus major)、大菱鲆(Scophthalmus maximus)是我国重要的海水养殖经济品种,本论文以这两种海水鱼为材料,研究分析外源DNA对其精子生理特性的影响及其转染效果,进一步实验探讨这两种海水鱼类SMGT技术的可行性和改进方法,主要结果如下:
1)外源DNA对真鲷精子活力的影响并不显著,仅在质粒pPmvasGFP达到2μg/106个精子的高浓度时,精子的运动速度稍有下降,5μg/106个精子的pPmvasGFP质粒孵育精子12h后,平均直线速度(VSL)相较于对照组低22.0%,但平均曲线速度(VCL)和精子活率(MOT)和并未减少。用pPmvasGFP和带荧光素标记的DNA片段孵育真鲷精子后,PCR检测和荧光观察发现,外源DNA吸附在部分精子表面(1μg/106个精子浓度处理下约31.90+5.65%),但并没有进入精子。经外源DNA处理的真鲷精子人工授精后,提取仔鱼基因组进行PCR检测,阳性率为0%,吸附在精子表面的外源DNA片段并没有转入子代产生转基因真鲷。
2)外源DNA下大菱鲆的精子活力变化与真鲷相似,影响不显著。带荧光素的DNA片段孵育大菱鲆精子后,荧光观察同样发现精子表面吸附有外源DNA。PCR检测发现,质粒pEGFP-N1通过直接孵育的方法不能进入大菱鲆精子,当用pEGFP-N1与脂质体的复合物处理大菱鲆精子时,精子基因组DNA中能够检测到外源DNA的信号。脂质体法SMGT处理大菱鲆精子后人工授精,提取仔鱼基因组进行PCR检测,阳性率为0%。根据结果推测外源DNA与脂质体形成复合体后,能够融合嵌于大菱鲆精子质膜当中,这部分外源DNA在精卵结合过程会被除去,不能转入子代产生转基因大菱鲆。
    以上研究表明,真鲷、大菱鲆精子并不具备自源吸收内化外源DNA的能力,直接孵育的SMGT方法在这两种海水鱼中较难实现。脂质体法虽然能使外源DNA融合嵌于精子质膜,仍然无法达到转基因的目地。游离在精子外部和吸附在精子表面的外源DNA,其浓度在较高水平下对精子活力的影响也不显著,进一步需要采取其它一些手段,使外源DNA真正穿透质膜进入精子内部。
    此外,本论文包含了与转基因相关的一些工作。通过染色体步移克隆了大菱鲆vasa基因的转录调控序列,分析潜在的核心调控序列并将其扩增连入pEGFP-N1载体,构建由vasa基因转录调控序列驱动的绿色荧光蛋白(GFP)表达载体pSMvasGFP,为进一步结合精子介导技术将载体转入大菱鲆, 使GFP在大菱鲆原始生殖细胞(PGCs)中特异表达的研究提供基础。
语种中文
文献类型学位论文
条目标识符http://ir.qdio.ac.cn/handle/337002/18041
专题海洋生物技术研发中心
推荐引用方式
GB/T 7714
郑君飘. 真鲷(Pagrus major)和大菱鲆(Scophthalmus maximus)精子介导转基因的初步研究[D]. 北京. 中国科学院研究生院,2014.
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