海洋生态与环境科学重点实验室知识库

硅藻 (Diatom) 是光合藻类，也是浮游植物的主要类群之一。硅藻几乎遍布全球，其中海洋硅藻光合作用每年固定的碳与所有陆地雨林的总量相当，是地球二氧化碳循环的重要组成部分，在生物地球化学循环中有至关重要的意义。硅藻占水生生物量的很大一部分，是重要的初级生产力，也是海洋食物网的重要组成部分。硅藻在商业应用中也有很大的价值，包括水产养殖业，生物活性物质，生物柴油等。很多硅藻物种能够形成有害藻华 (Harmful algae blooms)，是有害藻华物种 (HAB species)。部分硅藻物种还可以产生毒素，对生态环境与人体健康造成危害。据估计硅藻有 200,000 种，但是得到鉴定和描述的硅藻物种只占其中很小的部分，绝大多数硅藻物种仍未得到鉴定，因此我们对硅藻物种多样性的认识还很有限。早期对于硅藻的鉴定主要依赖于硅藻的形态特征。尽管很多硅藻物种具有独特的形态特征，给分类学家重要的抓手，极大地促进了硅藻多样性的研究，但由于有些硅藻物种的形态高度相似和可塑性，导致近源物种很难得到充分的区分。分子方法的引入是对硅藻多样性研究很好的补充，由此硅藻物种的分子标记数据也逐步增加。但是很快单基因分子标记被发现具有分辨率不足的问题，常常无法区分同属的近源物种。近年来，由于高通量DNA测序技术和生物信息学分析方法的快速发展，细胞器基因组（包括线粒体基因组和叶绿体基因组）和核糖体基因簇逐步作为分子标记以提升对不同物种的分辨率。由于这些分子标记的长度大大超过了单基因分子标记，且具有更多的变异以区分近源物种，被称为超级条形码 (super-barcode)。本研究以胶州湾海域的硅藻为研究对象，进行了单细胞分离和培养，利用高通量DNA测序技术和生物信息学分析方法系统构建胶州湾硅藻物种的三种超级条形码并进行比较分析。本研究完成构建了17个线粒体基因组，25个叶绿体基因组和25个核糖体基因簇转录单元，主要研究结果有：

1.线粒体基因组 (mtDNAs) 的构建与比较分析

首先通过构建两株胶州湾硅藻Odontella regia、Lithodesmium nudulatum的mtDNAs来搭建和完善超级条形码分析流程，包括硅藻单细胞的分离培养、DNA提取、建库测序、基因组组装、筛选mtDNAs、组装结果的比对与质检、基因组的注释和比较分析。这个分析流程中的多个步骤实现了自动化。

在此基础上又构建了15个mtDNAs，这17个硅藻mtDNAs极大提高了硅藻mtDNA的代表性。线粒体基因组能够有效区分不同硅藻物种。除此之外，比较这17 个 mtDNAs发现常作为单基因分子标记的cox1存在基因复制，出现了多个序列不同的cox1基因。尽管不同目硅藻物种的mtDNAs显示复杂的遗传进化关系且存在显著的基因组重组，但是同一目内的mtDNAs表现出较高的保守性，比较研究mtDNA可以帮助了解它们在硅藻的进化和多样性形成中所起的作用。有趣的是，Odontella物种线粒体基因组所有基因位于同一条链上，不过这样的基因分布对基因表达调控的影响还有待研究。线粒体基因组还可以用于估算硅藻物种的起源时间。分析发现硅藻物种大多起源于侏罗纪 (Jurassic)，在白垩纪 (Cretaceous) 中期物种开始变多，在新生代 (Cenozoic) 硅藻的物种数量开始明显上升。

2. 叶绿体基因组 (cpDNAs) 的构建与比较分析

成功构建了25个硅藻物种的完整cpDNAs，包括6个硅藻科物种、5个舟型藻目物种、9个中型硅藻纲物种和5个圆筛藻纲物种。这些cpDNAs序列可以用于区分不同硅藻物种，显示出很高的分辨率。除此之外，通过与已发表硅藻物种cpDNAs的比较分析发现cpDNAs存在蛋白编码基因丢失现象，反向重复 (IR) 区具有很高可塑性，不同物种的IR区长度和包含的蛋白编码基因数目差异很大。在这些cpDNAs中，硅藻科物种cpDNAs显示出尤其高的多样性，不同物种的cpDNAs显示出复杂的重组和遗传进化关系。特别是 Nitzschia 和 Cylindrotheca 属的 cpDNAs 中存在许多基因组重排，表明属内的物种具有很高的多样性。根据全长18S rDNA序列的相似性>99%，序列覆盖度>95%鉴定的Cylindrotheca closterium 物种的cpDNAs之间存在很高的差异（例如基因组重组），表明Cylindrotheca closterium中存在多个隐存种。舟型藻目物种间的cpDNAs显示较高的差异，比如Navicula 、 Haslea 属内物种间的cpDNA显示高度的基因组重组。Haslea属物种 (Haslea tsukamotoi 和 Haslea avium) 与 Navicula 属物种的遗传进化关系更近，表明这两个属的遗传进化地位需要重新评估。 Pleurosigma sp. 是 Pleurosigma 属的第一个参考 cpDNA，在系统发育分析中形成了一个独立的进化枝。

中型硅藻纲物种的系统发育分析与共线性分析表明Hemiaulaceae科的Hemiaulus sinensis与Chaetocerotaceae科的遗传进化关系更近。古老的硅藻谱系Leptocylindraceae虽然物种不多，却是目前所研究的硅藻中最早分化出来的。圆筛藻纲物种的共线性比较分析揭示了Coscinodiscales目的Hemidiscaceae与Coscinodiscaceae科物种之间保守的基因组结构以及Rhizosoleniaceae科物种间高度多样的基因组结构。叶绿体基因组分析也发现硅藻起源于侏罗纪 (Jurassic)，在白垩纪 (Cretaceous) 中期物种开始变多，在新生代 (Cenozoic) 硅藻的物种数量开始明显上升。

3. 核糖体基因簇转录单元的构建与比较分析

我们首次系统构建硅藻的核糖体基因簇转录单元18S rDNA-ITS1-5.8S rDNA-ITS2-28S rDNA，包括分离自胶州湾的25个硅藻物种的核糖体基因簇。比较分析发现硅藻物种的ITS1的长度变化范围比ITS2更大，5.8S rDNA长度非常保守，系统发育分析显示的遗传进化关系与细胞器基因组分析结果高度相似。

利用位于细胞质的两种超级条形码（线粒体、叶绿体）比较分析获得的硅藻物种形成时间基本一致，表明尽管二者具有不同的突变速率，但它们都可以用于准确分析硅藻的遗传进化关系。除了序列差异，硅藻物种的细胞器基因组也存在复杂的结构差异，为区分不同硅藻物种提供了更加丰富的证据。与基于形态学的研究方法相比，基于细胞器基因组研究的遗传进化关系显示出多方面的不同。比如，硅藻纲中Nitzschia、Haslea属内物种间高度的基因组重排和远比目前的分类地位更复杂的遗传进化关系；中型硅藻纲中Briggerales目与Lithodesmiales目的物种遗传进化关系更近；圆筛藻纲Coscinodiscales目的Hemidiscaceae与Coscinodiscaceae科物种之间保守的基因组结构等。而另一种位于细胞核的超级条形码 (核糖体基因簇18S rDNA-ITS1-5.8S rDNA-ITS2-28S rDNA) 所反映出的硅藻遗传进化关系也很复杂。比如硅藻纲中Nitzschia，Haslea属内物种间的遗传进化关系远比目前的分类地位更复杂。但也有与前两种超级条形码不同的地方，比如，虽然中型硅藻纲中Briggerales目与Lithodesmiales目的物种形成一个进化枝，但是Briggerales目的Helicotheca tamesis并没有像在其他两种超级条形码分析中一样与Lithodesmiales目Lithodesmioides sp.的形成一个进化枝，而是在大的进化枝中独立成一支。

本研究主要创新点在于利用高通量DNA测序与生物信息学分析方法一次性构建一个硅藻株系的多个分子标记，包括各种单基因分子标记以及线粒体基因组、叶绿体基因组和核糖体基因簇三种超级条形码，用于硅藻物种鉴定和硅藻多样性分析，也可以用于分析硅藻物种的分化时间。这个分析流程具有效率高和成本低等特点。本研究以胶州湾硅藻为例，首次利用单基因分子标记与三种超级条形码对硅藻物种进行鉴定，开展了对硅藻细胞器基因组的结构变异分析，并利用超级条形码对硅藻物种的分化时间进行了分析。本论文研究成果不仅提高了我们对硅藻多样性、遗传进化与物种形成的了解，也极大了丰富了硅藻物种的分子数据，为以后硅藻的研究提供了有价值的分子数据。随着测序技术的继续发展，以及生物信息学分析流程的不断完善，更多物种的超级条形码会得到构建，会进一步促进硅藻多样性与遗传进化的研究。

第1章     引言... 1

1.1硅藻的重要性... 1

1.2硅藻的多样性... 2

1.3我国硅藻多样性的研究进展及局限... 4

1.4 “超级条形码”—硅藻多样性研究的新方法... 6

1.5典型近海生态系统—胶州湾... 10

1.6研究内容与意义... 11

第2章     线粒体基因组比较分析... 15

2.1基于生物信息学方法构建与分析硅藻线粒体基因组... 15

2.1.1前言... 15

2.1.2材料与方法... 16

2.1.3结果... 16

2.1.3.1高盒形藻的形态和分子特征... 16

2.1.3.2线粒体基因组构建方法的建立... 17

2.1.3.3线粒体基因比较分析方法的构建... 18

2.1.3.4硅藻线粒体基因组大小和基因组成... 18

2.1.3.5高盒形藻与其他硅藻物种的系统发育分析... 23

2.1.3.6共线性分析揭示了广泛的重排事件... 24

2.1.4讨论... 28

2.2线粒体基因组的比较分析揭示了硅藻的生物多样性和物种形成... 28

2.2.1前言... 28

2.2.2材料与方法... 30

2.2.2.1株系分离培养与物种鉴定... 30

2.2.2.2 DNA文库制备与测序... 30

2.2.2.3线粒体基因组的构建与注释... 30

2.2.2.4线粒体基因组的系统发育分析... 31

2.2.2.5线粒体基因组的共线性分析... 31

2.2.2.6分化时间的估算... 31

2.2.3结果... 31

2.2.3.1 十五个硅藻物种的形态和分子特征... 31

2.2.3.2线粒体基因组的大小与基因组成... 34

2.2.3.3十五个线粒体基因组的系统发育分析... 41

2.2.3.4线粒体基因组的共线性分析... 44

2.2.3.5硅藻物种分化时间的估计... 49

2.2.4讨论... 50

2.2.4.1硅藻多样性和物种形成... 50

2.2.4.2基因丢失与复制... 50

2.2.4.3硅藻的遗传进化关系... 51

2.2.4.4共线性分析... 52

2.2.4.5硅藻多样性的起源和物种形成... 52

2.3小结... 53

第3章     叶绿体基因组比较分析... 55

3.1 硅藻科物种叶绿体基因组的比较分析... 55

3.1.1前言... 55

3.1.2材料与方法... 56

3.1.2.1株系分离培养与鉴定... 56

3.1.2.2 DNA文库制备与测序... 57

3.1.2.3叶绿体基因组的构建与注释... 57

3.1.2.4叶绿体基因的系统发育分析... 57

3.1.2.5共线性分析... 58

3.1.2.6分化时间的估算... 58

3.1.3结果... 58

3.1.3.1六株硅藻科硅藻的形态和分子特征... 58

3.1.3.2叶绿体基因组的大小与基因组成... 59

3.1.3.3 硅藻科物种IR区的可塑性... 64

3.1.3.4 硅藻科物种系统发育分析... 65

3.1.3.5 硅藻科物种的种间和种内共线性分析... 66

3.1.3.6 硅藻科物种的分化时间... 68

3.1.4讨论... 69

3.1.4.1叶绿体基因组作为超级条形码... 69

3.1.4.2 硅藻科物种IR 区可塑性的基因丢失... 70

3.1.4.3 硅藻科物种间广泛的基因组重排... 70

3.1.4.4 硅藻科物种的起源与形成... 71

3.2 舟型藻目物种叶绿体基因组的比较分析... 71

3.2.1前言... 71

3.2.2材料与方法... 72

3.2.2.1株系分离培养与鉴定... 72

3.2.2.2 DNA文库制备与测序... 73

3.2.2.3叶绿体基因组的构建与注释... 73

3.2.2.4叶绿体基因的系统发育分析... 73

3.2.2.5共线性分析... 74

3.2.2.6分化时间的估算... 74

3.2.3结果... 74

3.2.3.1五株舟型藻目硅藻的形态和分子特征... 74

3.2.3.2叶绿体基因组的大小与基因组成... 76

3.2.3.3舟型藻目物种IR区的可塑性... 78

3.2.3.4舟型藻目物种系统发育分析... 79

3.2.3.5共线性分析... 80

3.2.3.6舟型藻目物种的分化时间... 83

3.2.4讨论... 84

3.3 中型硅藻纲物种叶绿体基因组的比较分析... 85

3.3.1前言... 85

3.3.2 材料与方法... 86

3.3.2.1株系分离培养与鉴定... 86

3.3.2.2 DNA文库制备与测序... 86

3.3.2.3叶绿体基因组的构建与注释... 87

3.3.2.4叶绿体基因的系统发育分析... 87

3.3.2.5共线性分析... 87

3.3.2.6分化时间的估算... 87

3.3.3结果... 87

3.3.3.1九株中型硅藻纲硅藻的形态和分子特征... 87

3.3.3.2叶绿体基因组的大小与基因组成... 89

3.3.3.3中型硅藻纲物种 IR区的可塑性... 91

3.3.3.4中型硅藻纲物种系统发育分析... 92

3.3.3.5共线性分析... 93

3.3.3.6中型硅藻纲物种的分化时间... 97

3.3.4讨论... 98

3.4圆筛藻纲物种叶绿体基因组的比较分析... 100

3.4.1前言... 100

3.4.2 材料与方法... 101

3.4.2.1株系分离培养与鉴定... 101

3.4.2.2 DNA文库制备与测序... 101

3.4.2.3叶绿体基因组的构建与注释... 101

3.4.2.4叶绿体基因的系统发育分析... 101

3.4.2.5共线性分析... 102

3.4.2.6分化时间的估算... 102

3.4.3结果... 103

3.4.3.1五株圆筛藻纲硅藻的形态和分子特征... 103

3.4.3.2叶绿体基因组的大小与基因组成... 104

3.4.3.3圆筛藻纲物种 IR区的可塑性... 107

3.4.3.4圆筛藻纲物种系统发育分析... 108

3.4.3.5共线性分析... 109

3.4.3.6圆筛藻纲物种的分化时间... 111

3.4.4讨论... 112

3.5 小结... 113

第4章     核糖体基因簇比较分析... 115

4.1前言... 115

4.2材料与方法... 116

4.2.1 DNA文库制备与测序... 116

4.2.2 核糖体基因簇的构建与注释... 116

4.2.3系统发育分析... 116

4.3结果... 116

4.3.1核糖体基因组的基本特征... 116

4.3.2系统发育分析... 117

4.4讨论... 118

4.5小结... 119

第5章     总结与展望... 121

5.1主要结论... 121

5.2主要创新点... 123

5.3研究展望... 124

参考文献... 125

附录一 我国海域硅藻分类信息... 143

附录二 本研究的硅藻株系信息... 177

致 谢... 179

作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果... 181