海洋生物分类与系统演化实验室知识库

海洋中多变的环境因素与复杂的生态组成孕育了多种拥有独特代谢途径与代谢方式的海洋微生物。由于技术的局限，大多数微生物无法在实验中以培养的方法分离，这限制了人们对海洋微生物生理生化、新陈代谢和进化发育的认识。因此，研究海洋微生物不仅有助于探索新的环境适应机制，还对物种起源与进化具有十分重要的意义。

本研究从来自西太平洋卡罗琳海山的海绵样品中分离到菌株KN72^T，并使用多相分类学手段进行了分类鉴定。KN72^T菌株为革兰氏染色阴性、严格需氧，菌体弯曲至螺旋杆状。菌株KN72^T与红螺菌科的成员Hwanghaeella grinnelliae Gri0909^T （92.3%）、Marivibrio halodurans ZB80^T（91.0%）和Aestuariispira insulae AH-MY2^T（90.1%）的16S rRNA基因序列相似性最高。KN72^T菌株的DNA G+C含量为61.1%。基于表型、化学分类学、系统发育和基因组证据，菌株KN72^T代表了红螺菌科下的一个新属（Pacificispira）的一个新物种，其模式种为Pacificispira spongiicola，模式菌株为KN72^T（= CGMCC 1.17142^T = KCTC 72429^T）。

为了调查海洋氮循环中涉及的微生物，本研究采用可培养的方法从长江口海洋低氧区（oxygen minimum zones，OMZ）内的 17 个站位的水体样品中分离出164株硝酸盐利用细菌，并对它们的多样性和氮代谢进行了研究。它们主要隶属于变形菌门（81.1%）、放线菌门（5.5%）、拟杆菌门（12.3%）和厚壁菌门（0.6%）。大多数站点都发现了Pseudomonas aeruginosa，Sphingobium naphthae和Zunongwangia profunda。以24株分离株作为代表菌株，其中8株呈现硝酸还原阳性。铜绿假单胞菌含有全程反硝化的基因（napAB、norBC、nirS 和 nosZ），可能负责介导低氧区内的反硝化反应。66%的代表性分离株（16/24）含有将硝酸盐还原为亚硝酸盐的基因（nasA、napAB 或 narGHI），79%的代表性分离株（19/24）含有将亚硝酸盐转化为氨的基因（nirA或nirBD），这表明了分离株利用亚硝酸盐能力的多样性。

在微生物的反硝化过程中，NirS型亚硝酸盐还原酶一直是研究的重点之一, 但是独特的酶活中心血红素d1阻碍了其在工业上的广泛应用。本研究以长江口低氧区分离的海运海杆菌36-1的亚硝酸盐还原相关基因nirF

为研究对象，通过同源重组的方法构建nirF基因缺陷的海运海杆菌36-1菌株，以初步探究nirF基因在亚硝酸盐还原过程中的作用。结果表明，nirF基因的缺失不影响36-1菌株在好氧条件下的生长，但是严重阻碍了其在厌氧条件下利用亚硝酸盐的能力。通过转录组学的比较分析，我们发现nirF缺失导致了反硝化和血红素d1合成有关基因的上调表达，以及硝酸盐分支利用途径、其它血红素合成途径的下调。表明nirF基因可能通过影响血红素d1以影响NirS 的功能，其存在是海运海杆菌正常还原亚硝酸盐的必要条件。

本次研究通过鉴定一株新属新种，拓展了红螺菌科的新的分支；通过培养方法对低氧区微生物进行调查，进一步阐明了微生物群体在低氧区特殊生境中的作用，填补了相关研究的空白；通过基因敲除与转录组学的方法对nirF基因的功能进行了初步调查，为进一步探究该基因的功能拓展了前路。

The changing environmental factors and complex ecological composition in the ocean have given birth to a variety of marine microorganisms with unique metabolic pathways. However, due to the limitations of technology, most of microbes cannot be isolated by the culture method in laboratory, which limits people's understanding of the physiology, biochemistry, metabolism, and evolution of marine microorganisms. Therefore, the study of marine microorganisms helps to explore new environmental adaptation mechanisms and has great significance for the origin and evolution of life.

第1章 引言... 1

1.1 海洋微生物研究进展... 1

1.2 海洋细菌分类鉴定... 2

1.2.1 表型特征及化学特征... 2

1.2.2 16S rRNA 基因... 2

1.2.3 基因组序列... 3

1.3 反硝化细菌与低氧区... 4

1.3.1 反硝化与反硝化细菌... 4

1.3.2 低氧区与长江口低氧区... 5

1.3.3 低氧区的反硝化微生物... 7

1.4 反硝化基因与反硝化酶... 8

1.4.1 硝酸盐还原酶... 9

1.4.2 亚硝酸盐还原酶NIR.. 10

1.4.3 一氧化氮还原酶 NOR.. 11

1.4.4 一氧化亚氮还原酶NOS. 12

1.5 影响反硝化酶转录的环境因素... 12

1.5.1 氧气... 12

1.5.2 硝酸盐、亚硝酸盐的含量... 13

1.5.3 电子供体... 13

1.6 反硝化过程中转录调节... 14

1.7 血红素D1合成及各个NIR基因的功能... 15

1.8 立题意义与依据... 18

1.9 主要研究内容... 18

第2章 一株来自卡罗琳海山的新属细菌的鉴定... 21

2.1 实验材料与试剂... 21

2.1.1样品采集... 21

2.1.2 实验药品与实验仪器... 21

2.1.3 实验试剂及培养基... 23

2.2 实验方法... 23

2.2.1 菌株纯化，保藏与复苏... 23

2.2.2 形态学鉴定... 23

2.2.3 生理生化特征鉴定... 24

2.2.4 化学分类学特征鉴定... 26

2.2.5 16S rRNA基因测序与系统发育分析... 26

2.2.6 全基因组测序与系统发育分析... 28

2.3 实验结果与分析... 28

2.3.1 形态学特征... 28

2.3.2 生理生化特征... 30

2.3.3 化学特征... 31

2.3.4 16s rRNA基因测序与系统发育... 32

2.3.5 基因组测序与系统发育... 35

2.4 小结与讨论... 38