海洋生态与环境科学重点实验室知识库

    甲藻作为浮游植物的主要类群，是近海海洋生态系统中微食物网的基础和初级生产力的主要贡献者。但是，甲藻中也包含了40%的有害藻华原因种，且全球75%以上的有害藻华事件都由甲藻引起。甲藻的营养生态学一直以来都是有害藻华生态学研究的热点领域，但是目前研究方向多集中于甲藻的光合自养和对氮、磷等大量元素的需求，而对于混合营养（mixotrophy）、对维生素等有机物的依赖性营养（auxotrophy）和对痕量金属等微量元素的特殊营养生态学研究相对较少。本论文分别以卡尔藻属中有毒有害的南方卡尔藻Karlodinium australe和剧毒卡尔藻K. veneficum为代表性种类，利用生理生态学和分子生物学多种研究方法对甲藻吞噬营养（phagotrophy）和维生素B₁₂（钴胺素）依赖性营养这两种特殊的营养方式展开研究，为从多样化的营养生态策略角度解释有害藻华甲藻的竞争优势提供实证性依据。关于南方卡尔藻吞噬营养的研究，通过对南方卡尔藻吞噬行为的观察，三种毒理学模式生物褶皱臂尾轮虫（Brachionus plicatilis）、卤虫（Artemia salina）、海洋青鳉鱼（Oryzias melastigma）在南方卡尔藻藻液中的暴露实验，和对南方卡尔藻与同属的典型有毒有害藻华甲藻剧毒卡尔藻的致死效应进行比较，揭示了南方卡尔藻通过微捕食（micropredation）在较低细胞密度赤潮时即能造成大量鱼类死亡的原因。关于甲藻维生素B₁₂依赖性营养的研究：本实验室已经证明了多数甲藻是维生素B₁₂营养依赖型（即以维生素B₁₂为必需营养但不能自己合成），并已基本阐明甲藻维生素B₁₂依赖性营养的遗传学基础。但是，在对尖顶斯氏藻Scrippsiella acuminata转录组学研究和环境样品的宏转录组学研究中却发现甲藻中存在被注释为钴胺素合成酶W的CBWD基因。因此，这些基因在甲藻中是否参与维生素B₁₂的生物合成、是否对维生素B₁₂水平产生表达响应、是否行使其它功能就成为重要科学问题。为此，本研究通过对甲藻转录组和基因组数据库中CBWD基因的搜索、甲藻CBWD基因全长序列的cDNA末端快速扩增技术（RACE）、系统进化分析、实时荧光定量PCR检测等，获得了对甲藻中CBWD基因功能的重要科学认知。主要研究结果如下：

（1）南方卡尔藻通过吞噬营养形成的微捕食致死海洋动物

通过观察南方卡尔藻的吞噬行为，发现南方卡尔藻是一种广食性的吞噬营养甲藻，它可以捕食微藻、浮游动物和幼鱼，且在其捕食过程中存在灵活多变的摄食机制，具体表现为对个体较小的猎物的直接吞噬和对个体较大的猎物通过捕食茎摄食。更重要的是，通过研究南方卡尔藻对三种模式生物（褶皱臂尾轮虫、卤虫和海洋青鳉鱼幼鱼）的致死效应并对南方卡尔藻和剧毒卡尔藻的致死效应进行比较，发现与广为人知的剧毒卡尔藻通过毒素致鱼死亡的机制显著不同，南方卡尔藻在较低细胞密度下主要是通过吞噬作用也即微捕食致使海洋动物死亡。这一观察很好地解释了该藻在野外的低密度藻华就造成了大量鱼类死亡的现象。本部分研究为吞噬营养在有害藻华事件中的作用及其对生态系统的危害效应提供了新的事实依据和认识思路。

（2）甲藻中存在多个不同的CBWD基因

通过对四种甲藻转录组数据和基因组数据中的CBWD基因进行检索，发现剧毒卡尔藻中存在18个CBWD基因，尖顶斯氏藻中存在14个CBWD基因，虫黄藻Symbiodinium microadriaticum和Fugacium kawagutii中也分别发现了16个和20个CBWD基因。基于以上转录组数据中CBWD基因片段序列，通过RACE技术获得剧毒卡尔藻三个CBWD基因和尖顶斯氏藻两个CBWD基因的cDNA全长序列。使用CD search保守结构域预测工具对甲藻中CBWD基因进行功能域预测，发现甲藻中CBWD蛋白属于一个庞大的金属伴侣蛋白家族，即COG0523家族。

（3）甲藻CBWD基因与维生素B₁₂生物合成无关

以全球广布的有毒有害甲藻剧毒卡尔藻为甲藻代表种类，通过RT-qPCR对八个KvCBWD基因在维生素B₁₂营养限制与补充恢复条件下的表达模式进行研究，发现KvCBWD基因对维生素B₁₂浓度不存在特定的响应关系。结合系统进化分析中甲藻CBWD基因都没有聚类到第12功能亚群（成员为真正行使维生素B₁₂合成功能的CobW基因），可明确判断甲藻中那些被注释为CBWD的基因其实与维生素B₁₂的生物合成无关。

（4）部分甲藻CBWD基因与锌或铁离子内稳态有关

通过对包括甲藻在内的多个物种的CBWD基因进行系统进化分析，表明多数甲藻CBWD基因属于COG0523家族中与锌或铁离子内稳态相关的第1、第2和第5功能亚群。保守基序分析和蛋白空间结构预测的结果也表明甲藻CBWD蛋白中存在支持其GTPase活性和结合金属离子的结构基础。基于系统进化分析和RT-qPCR检测结果，总结剧毒卡尔藻CBWD基因在锌离子、铁离子限制-恢复实验中的表达规律如下：KvCBWD4、6、8、9四个在进化树上属于第5功能亚群的CBWD基因，其转录水平显著受到锌离子浓度调控，在锌离子过量和不足时基因表达量均显著上调；在进化树上属于第2功能亚群的KvCBWD1基因，其转录水平显著受到铁离子浓度的调控，即在铁离子缺乏时表达显著上调，而铁离子浓度经补充恢复后表达量相应下调。根据上述KvCBWD基因在锌或铁离子不同浓度下的表达模式，可推测它们在剧毒卡尔藻细胞内可能参与锌离子内稳态维持和依赖于铁的腈水合酶激活。对文献中虫黄藻Fugacium kawagutii在各种痕量金属元素限制条件下的转录组数据进行重新分析，结果也表明，多个FkCBWD基因的表达量受到金属离子的调控，尤其是锌离子和铁离子。综合上述结果，甲藻中含有CobW结构域、被注释为钴胺素合成酶W的CBWD基因并不行使维生素B₁₂合成功能，而是参与了细胞内锌离子与铁离子内稳态的维持。这一研究结果为研究甲藻中CBWD编码蛋白乃至整个COG0523蛋白家族的功能提供了重要基础。

第1章 引言... 1

1.1 有害藻华... 1

1.1.1 概述... 1

1.1.2 甲藻藻华... 2

1.2 甲藻的营养方式... 3

1.2.1 甲藻多样的营养方式... 3

1.2.2 混合营养与混养浮游生物：新的研究范式... 4

1.2.3 吞噬营养... 5

1.2.4 依赖性营养... 10

1.3 卡尔藻... 15

1.3.1 分类地位... 15

1.3.2 剧毒卡尔藻... 16

1.3.3 南方卡尔藻... 18

1.4 本研究的科学问题... 18

第2章 南方卡尔藻通过吞噬作用形成的微捕食致死海洋动物... 21

2.1 实验材料... 21

2.1.1 藻种和受试动物... 21

2.2.2 实验仪器与试剂... 22

2.2 实验方法... 23

2.2.1 藻种培养... 23

2.2.2 对南方卡尔藻摄食行为的显微观察... 24

2.2.3 南方卡尔藻摄食器官的扫描电镜（SEM）观察... 25

2.2.4 海洋动物的暴露实验... 25

2.2.5 南方卡尔藻与剧毒卡尔藻致死效应的比较... 27

2.2.6 数据分析... 28

2.3 实验结果... 28

2.3.1 南方卡尔藻的食性与摄食机制... 28

2.3.2 南方卡尔藻对海洋动物的致死作用... 34

2.3.3 南方卡尔藻与剧毒卡尔藻致死作用的比较... 38

2.4 讨论... 40

2.4.1 南方卡尔藻的吞噬营养... 40

2.4.2 微捕食是南方卡尔藻致死海洋动物的关键原因... 42

2.4.3 南方卡尔藻致死效应强于剧毒卡尔藻... 43

2.5 本章小结... 44

第3章 剧毒卡尔藻CBWD基因功能与维生素B₁₂依赖性营养无关... 45

3.1 剧毒卡尔藻CBWD基因和尖顶斯氏藻CBWD基因全长克隆与序列分析... 45

3.1.1 实验材料... 45

3.1.2 实验方法... 46

3.1.3 实验结果... 54

3.1.4 讨论与结论... 56

3.2 不同维生素B₁₂水平下剧毒卡尔藻CBWD基因表达情况... 56

3.2.1 实验材料... 56

3.2.2 实验方法... 56

3.2.3 实验结果... 61

3.2.4 讨论与结论... 62

3.3 甲藻CBWD基因系统进化分析与序列功能性分析... 63

3.3.1 研究方法... 63

3.3.2 研究结果... 64

3.3.3 讨论与结论... 69

3.4 不同锌离子水平下剧毒卡尔藻CBWD基因表达情况... 70

3.4.1 实验材料... 70

3.4.2 实验方法... 71

3.4.3 实验结果... 71

3.4.4 讨论与结论... 75

3.5 不同铁离子水平下剧毒卡尔藻CBWD基因表达情况... 76

3.5.1 实验材料... 76

3.5.2 实验方法... 76

3.5.3 实验结果... 77

3.5.4 讨论与结论... 80

3.6 不同金属离子水平下虫黄藻FkCBWD基因表达情况... 80

3.6.1 研究方法... 80

3.6.2 研究结果... 81

3.6.3 讨论与结论... 83

3.7 本章小结... 84

第4章 结论、创新点与展望... 87

4.1 主要结论... 87

4.2 创新点... 88

4.3 展望... 89

参考文献... 91

附  录... 109

致  谢... 119

作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果... 121