实验海洋生物学重点实验室知识库

坛紫菜是一种经济红藻，谷氨酸和天冬氨酸是其主要的呈味氨基酸，也是坛紫菜风味判断的主要指标。谷氨酸和天冬氨酸的合成及相关基因和酶的功能解析，对其品质性状具有重要意义，也对坛紫菜品种的选择和在水产养殖中的应用有重要意义。

本研究对坛紫菜中参与谷氨酸合成的谷氨酸脱氢酶(NhGDH)进行了分析。对2个GDH基因序列（NhGDH1和NhGDH2）进行克隆，并实现了其在大肠杆菌中的表达。结构分析表明，NhGDH1和NhGDH2均包含ELFV_dehydrog和ELFV_dehydrog_N结构域，属于ELFV脱氢酶家族。NhGDH1和NhGDH2的开放阅读框（ORF）分别长1,386 bp和1,668 bp。两种NhGDHs的二级结构均以α-螺旋为主。采用AKTA pure系统对表达蛋白进行纯化，纯化后酶活检测结果表明NhGDHs可催化α-酮戊二酸生成谷氨酸。体外酶活实验表明NhGDH1和NhGDH2的最适温度均为25℃，最适pH分别为8.0和8.5。酶动力学分析表明NhGDH1对NADH、(NH₄)₂SO₄和α-酮戊二酸的K_m值分别为0.12、4.99和0.16 mM，而NhGDH2的K_m值分别为0.02、3.98和0.104 mM。定点诱变表明Gly¹⁹³和Thr³⁶¹可能是NhGDH2的重要活性位点。在干出、高温以及高铵胁迫下，NhGDH1和NhGDH2的转录水平均显著增加，表明其对逆境环境具有抵抗能力。

对天冬氨酸合成途径中的天冬氨酸转氨酶基因（NhAAT）进行克隆及分析，也实现了其在大肠杆菌中的表达。结构分析表明，NhAAT含有保守结构域Aminotran_1_2，属于转氨酶超家族。NhAAT的ORF长1,290 bp，编码429个氨基酸，编码蛋白分子量约为45 KDa。坛紫菜NhAAT的二级结构以α-螺旋为主。NhAAT能够在大肠杆菌中成功表达，酶活检测证实，NhAAT具有天冬氨酸转氨酶的活性，可催化谷氨酸和草酰乙酸生成天冬氨酸和a-酮戊二酸的可逆反应。

第1章 引言

1.1 坛紫菜

1.1.1 坛紫菜分类地位及生活史

1.1.2 坛紫菜品质性状研究

1.1.3 坛紫菜呈味氨基酸

1.1.4 坛紫菜抗逆机制

1.1.5 坛紫菜养殖及应用

1.2 谷氨酸

1.2.1 谷氨酸的合成代谢

1.2.2 谷氨酸在植物生理的功能

1.2.3 谷氨酸在藻类中的研究

1.2.4 谷氨酸的制备及应用

1.3 天冬氨酸

1.3.1 天冬氨酸的合成代谢

1.3.2 天冬氨酸在植物生理的功能

1.3.3 天冬氨酸在藻类中的研究

1.3.4 天冬氨酸的制备及应用

1.4 谷氨酸脱氢酶

1.4.1 谷氨酸脱氢酶概述

1.4.2 谷氨酸脱氢酶的生理功能

1.4.3 谷氨酸脱氢酶的结构特征

1.5 天冬氨酸转氨酶

1.5.1 天冬氨酸转氨酶概述

1.5.2 天冬氨酸转氨酶的生理功能

1.5.3 天冬氨酸转氨酶的结构特征

1.6 本研究的目的与意义

第2章 谷氨酸脱氢酶基因的研究

2.1 实验材料

2.1.1 实验样品

2.1.2 实验仪器

2.1.3 实验试剂及配制

2.2 实验方法

2.2.1 NhGDH1和NhGDH2的扩增及序列分析

2.2.2 NhGDH1和NhGDH2的体外表达及纯化分析

2.2.3 NhGDH1和NhGDH2的酶活分析

2.2.4 非生物胁迫下NhGDH1和NhGDH2转录水平的变化

2.3 实验结果

2.3.1 NhGDH1和NhGDH2的扩增及序列分析

2.3.2 NhGDH1和NhGDH2的体外表达及纯化分析

2.3.3 NhGDH1和NhGDH2的酶活分析

2.3.4非生物胁迫下NhGDH1和NhGDH2转录水平的变化

2.4 讨论

第3章 天冬氨酸转氨酶基因的研究

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.2.1 NhAAT的扩增及序列分析

3.2.2 NhAAT的体外表达及纯化分析

3.2.3 NhAAT的酶活分析

3.3 实验结果

3.3.1 NhAAT的扩增及序列分析

3.3.2 NhAAT的体外表达及纯化分析

3.3.3 NhAAT的酶活分析

3.4 讨论

第4章 结论

参考文献

致 谢

作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果