IOCAS-IR  > 实验海洋生物学重点实验室
白斑综合征病毒(WSSV)三种重要囊膜蛋白的重组表达及在病害防控中的作用
孙玉苗
Subtype博士
Thesis Advisor相建海
2011-05-23
Degree Grantor中国科学院研究生院
Degree Discipline海洋生物学
Keyword白斑综合症病毒(wssv) Vp28 活菌载体 脊尾白虾 Vp281
Abstract由白斑综合征病毒(WSSV)引起的白斑综合症自从20世纪90年代初在东亚爆发以来,迅速蔓延至全球,造成了巨大的经济损失,成为危害虾产业最严重的传染性病毒病。迄今没有有效的策略防控该病毒。病毒囊膜蛋白在与宿主细胞受体相互作用,启动病毒感染的发生或介导病毒的侵入方面起着重要作用。WSSV囊膜蛋白导入虾体内,能够起到保护宿主抵抗WSSV的效果。这一防控WSSV的策略成为近年研究的热点。本研究对使用活的大肠杆菌(Escherichia coli)作为病毒囊膜蛋白递送入虾体内的载体的WSSV防控策略做了探索;同时对两个WSSV囊膜蛋白VP281和VP31的功能做了初步观察判断。研究主要包括以下内容和结果。 1.本研究选择WSSV囊膜蛋白VP28,选用一种组成分泌型表达质粒pBTA1作为表达工具,使用活的大肠杆菌菌株DH5α作为递送载体,构建了表达VP28全长和膜外区的重组大肠杆菌,分别命名为DhpV和DhpVB。对两种重组菌的表达情况进行分析,结果显示二者皆能够组成型地表达目的蛋白,并顺利地把目的蛋白递送至胞外培养基中。 2.为了检验其保护潜力,向脊尾白虾(Exopalamon carincaudaHolthuis)中注射表达VP28的重组活菌DhpVB三次,在后两次导入重组活菌DhpVB的同时进行攻毒;使用含有空载体pBTA1的大肠杆菌作为对照。首次攻毒后,DhpVB和不带VP28的大肠杆菌在保护效果方面没有显著差别。第二次攻毒后,重组菌DhpVB显示出明显强于不带VP28的大肠杆菌的保护效果;重组菌DhpVB的抗性指数(Resistance index,RI)平均为0.67±0.08,不带VP28的大肠杆菌的RI为0.41±0.09;差异显著(P﹤0.05)。 3.使用pET-30a(+)为表达载体,使用大肠杆菌菌株BL21 (DE3) pLysS为表达菌株,以包涵体的形式表达了WSSV囊膜蛋白VP28、VP281和VP31并使用螯合Ni2+的琼脂糖凝胶柱对包涵体蛋白进行了纯化。使用梯度透析去除尿素的方法对目的蛋白进行复性。这为以后探索VP281和VP31是否也同VP28一样具有保护宿主抵抗WSSV作用打下基础。 4.尝试利用组成分泌型原核表达质粒pBTA1为表达载体,构建表达囊膜蛋白VP28、VP281或VP31的重组大肠杆菌菌株DH5α。组成型分泌rVP28和rVP281的重组菌构建成功,但含rVP281的重组菌与含rVP28的重组菌相比生长十分缓慢,推测rVP281的表达可能抑制大肠杆菌的生长。而组成型分泌rVP31的重组菌的构建未获成功。为弄清组成型分泌rVP31的重组菌未能成功构建的原因,使用pET-30a(+)为表达载体,构建了表达rVP31包涵体的重组菌株BL21 (DE3) pLysS。将rVP31蛋白纯化并复性后,采用牛津杯法,检测rVP31蛋白的抗菌活性。以溶壁微球菌为受试菌,出现抑菌圈,表明rVP31对其具有抗菌作用。 使用活的大肠杆菌有利于囊膜蛋白在虾体内的驻留;使用分泌型表达载体利于囊膜蛋白和虾的直接接触和相互作用。而且遗传背景清楚、大规模培养经济的大肠杆菌还可作为免疫增强剂增强保护效果。表达VP28的重组活菌在同虾发生足够的相互作用的条件下,能够提高虾抵抗WSSV的能力。本研究为防控WSSV提供了一个新的参考。另外,本研究首次观察到重组的WSSV囊膜蛋白VP281和VP31具有抗菌作用,增加了WSSV病毒学方面的知识。
Language中文
Document Type学位论文
Identifierhttp://ir.qdio.ac.cn/handle/337002/17819
Collection实验海洋生物学重点实验室
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GB/T 7714
孙玉苗. 白斑综合征病毒(WSSV)三种重要囊膜蛋白的重组表达及在病害防控中的作用[D]. 中国科学院研究生院,2011.
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