IOCAS-IR  > 实验海洋生物学重点实验室
萨氏海鞘多肽CS5931的克隆、表达、纯化及其抗肿瘤机制研究
赵进
Subtype博士
Thesis Advisor林秀坤
2013
Degree Grantor中国科学院研究生院
Degree Discipline海洋药物学
Keyword多肽 克隆 重组表达 抗肿瘤 蛋白互作
AbstractCS5931是从萨氏海鞘(Ciona savignyi)中分离得到的一种新型抗肿瘤多肽,分子量为5931Da。前期研究表明, CS5931对多种肿瘤细胞的生长有抑制活性,可以诱导人肝癌细胞BEL-7402凋亡。N-末端序列分析发现,CS5931与人颗粒体蛋白(granulin,GRN)有同源性。本研究利用分子生物学技术克隆了编码多肽CS5931全长cDNA序列,获得了CS5931的氨基酸序列,通过基因工程技术对其进行了重组表达,采用亲和层析技术获得了高纯度且具有天然多肽活性的重组多肽CS5931,然后对重组多肽抗肿瘤活性及其分子机制进行了深入研究。 利用RACE技术,克隆了编码CS5931的cDNA全长序列,命名为Cs-pgrn-1。Cs-pgrn-1由685个碱基组成,包括有一个由522个碱基组成的开放阅读框(ORF),编码173个氨基酸。通过生物信息学分析发现,Cs-pgrn-1含有两个序列相同的GRN保守结构域,每个结构域编码一个由58个氨基酸残基组成的多肽CS5931。进化关系分析发现CS5931的氨基酸序列与来源于玻璃海鞘(Ciona intestinalis)的GRN的氨基酸序列的同源性最高,达82.8%,与人GRN A、B、C的氨基酸序列也有很高的相似性,这说明CS5931在进化中高度保守。另外,CS5931的三维结构预测模型显示了其与人GRN A的三维结构有很高的相似性(RSM=1.54?)。 将编码多肽CS5931的基因片段分别连接到表达载体pET32a(+)和pET21a(+)中,构建了表达载体pET32a(+)-CS5931和pET21a(+)-CS5931,将两种载体分别转入到了大肠杆菌(E. coli)Origami(DE3)和含有分子伴侣质粒pG-KJE8的Origami(DE3)中,构建成了两种表达体系Origami/pET32a-CS5931和Origami/pET21a-CS5931+pG-KJE8,经诱导后分别表达含硫氧还蛋白标签的融合蛋白Trx-CS5931和重组多肽CS5931-His,且表达产物均为可溶性蛋白,说明硫氧还蛋白和分子伴侣蛋白都有助于CS5931分子内二硫键形成。表达的融合蛋白Trx-CS5931经变性纯化、复性和蛋白酶酶切,最后得到了重组多肽rCS5931,纯度大于95%;我们同时还获得了纯度大于95%的带有His-tag的重组多肽CS5931-His。重组多肽rCS5931和CS5931-His均具有较强的抑制人宫颈癌细胞Hela增殖的活性,IC50值分别为2.74μM和3.17μM,而二者的总回收率分别为1.8%和28.2%,所以表达体系Origami/pET21a-CS5931+pG-KJE8更适合用于大规模生产重组多肽。 通过MTT法评价了重组多肽CS5931-His对肿瘤细胞生长的抑制作用。结果表明,CS5931-His对人宫颈癌细胞Hela、人结肠癌细胞HCT116和RKO、人白血病细胞HL60以及人肺癌细胞A549均有增殖抑制作用,IC50值分别为3.17,2.00,5.14,4.29和4.78μM,这一结果表明CS5931-His对HCT116细胞作用最强。通过细胞形态观察、Hoechst 33258染色发现,HCT116细胞经4μM和8μM的重组多肽CS5931-His处理后出现了典型的细胞凋亡形态特征。又通过Annexin V-FITC/PI双染法进一步证实了CS5931-His能诱导HCT116细胞凋亡,并呈剂量依赖性关系。通过细胞免疫荧光实验发现,CS5931-His主要定位于HCT116细胞膜,与膜相关蛋白相结合。His-pull down和免疫沉淀实验结果显示,与CS5931-His发生相互作用的蛋白是位于细胞表面的人烯醇化酶1(Enolase 1)。又通过免疫共沉淀和细胞免疫荧光双标实验进一步证实了二者之间的相互作用,但CS5931抗肿瘤作用的发挥是否是通过影响Enolase 1的活性起作用还需进一步的实验验证。本研究对发展海洋多肽类抗肿瘤新药具有重要价值,对建立Enolase 1作为抗肿瘤药物的新靶标也具有重要意义。 关键词:多肽;克隆;重组表达;抗肿瘤;蛋白互作。
Language中文
Document Type学位论文
Identifierhttp://ir.qdio.ac.cn/handle/337002/17753
Collection实验海洋生物学重点实验室
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GB/T 7714
赵进. 萨氏海鞘多肽CS5931的克隆、表达、纯化及其抗肿瘤机制研究[D]. 中国科学院研究生院,2013.
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