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	三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）丝氨酸蛋白酶及其同源物的基因克隆和表达分析
	李倩倩
学位类型	硕士
导师	崔朝霞
	2012-05-05
学位授予单位	中国科学院研究生院
学位专业	海洋生物学
关键词	三疣梭子蟹 丝氨酸蛋白酶 丝氨酸蛋白酶同源物 Clip结构域 先天免疫
摘要	三疣梭子蟹（十足目：短尾次目：梭子蟹属）是我国重要的海水养殖品种，但随着养殖规模的不断扩大以及养殖集约化程度的不断提高，由细菌、真菌和病毒等引起的各种病害日趋严重，给三疣梭子蟹养殖业造成巨大损失。深入开展三疣梭子蟹免疫防御机制相关研究，探索免疫防治新途径，是实现其健康养殖的可靠保障。无脊椎动物中普遍存在的丝氨酸蛋白酶及其同源物参与了个体的先天免疫，包括血淋巴凝集，抗菌肽合成，细胞吸附和黑化反应等，这为我们研究三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶及其同源物在抵御外界微生物过程中的作用提供了重要依据。 本研究在实验室构建的三疣梭子蟹血细胞和眼柄全长cDNA文库基础上，依据测序得到的EST序列进行序列拼接、发现并确定了6条丝氨酸蛋白酶及其同源物cDNA全长序列，其氨基酸序列中均包含Tryp_SPc结构域。根据其氨基酸序列中N端是否带有clip domain而将丝氨酸蛋白酶及其同源物分为两组，一组是不带clip domain的丝氨酸蛋白酶（PtSP）和丝氨酸蛋白酶同源物（PtSPH1）。；另一组是带有clip domain的丝氨酸蛋白酶（PtcSP1-3）和丝氨酸蛋白酶同源物（PtcSPH）。丝氨酸蛋白酶同源物在序列上与丝氨酸蛋白酶类似，但催化三联体中的一个或多个保守残基发生突变，通常是丝氨酸（Ser）被甘氨酸（Gly）取代(PtSPH1)，而PtcSPH被称为同源物是由于第二个活性位点天冬氨酸（Asp）被丙氨酸（Ala）所取代。同时，采用分子生物学技术开展了对三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶6种亚型的基因结构、组织分布及菌液刺激情况进行研究，进一步探讨它们在三疣梭子蟹免疫防御中的作用。 PtSP 的cDNA序列全长为1266 bp, 包括一个70 bp的5′非翻译区（5′ UTR），一个335 bp的3′非翻译区（3′ UTR）和861 bp的开放读码框（ORF），可以编码286个氨基酸，其分子量为30.828kDa，等电点为6.07，氨基酸序列中有两个N糖基化位点；PtSPH1的 cDNA全长为1507 bp，PtSPH1 cDNA序列包含114 bp 的5′ UTR，157 bp 的3′ UTR且有36个PolyA尾巴，共编码411个氨基酸，其中17个为信号肽序列，在其氨基酸序列中含有一个N糖基化位点。PtcSP1、PtcSP2、PtcSP3和PtcSPH的cDNA序列全长分别为1513，1363，1461 和1530 bp，PtcSP1包括一个187 bp的5′非翻译区（5′ UTR），一个177 bp的3′非翻译区（3′ UTR）和1146bp的开放读码框（ORF），可以编码382个氨基酸；PtcSP2包括一个29 bp的5′非翻译区（5′ UTR），一个131 bp的3′非翻译区（3′ UTR）和1203 bp的开放读码框（ORF），可以编码400个氨基酸；PtcSP3包括一个24 bp的5′非翻译区（5′ UTR），一个189 bp的3′非翻译区（3′ UTR）和1243bp的开放读码框（ORF），可以编码415个氨基酸；PtcSPH包括一个70 bp的5′非翻译区（5′ UTR），一个320 bp的3′非翻译区（3′ UTR）和1137 bp的开放读码框（ORF），可以编码379个氨基酸；本研究中还克隆得到PtSP、PtSPH1基因组序列，PtSP的基因组有7个外显子和6个内含子，并发现在第一个外显子与内含子之间存在一个非正常剪接位点（GG-AG）；PtSPH1的基因组有5个外显子和4个内含子，PtSP、PtSPH1基因组中其它外显子内含子剪接位点均符合GT-AG规则。 为进一步分析丝氨酸蛋白酶及其同源物在先天免疫中所起到的作用，利用Real-time PCR的方法分析6个丝氨酸蛋白酶及其同源物基因在健康三疣梭子蟹各个组织分布与菌液刺激后时序表达情况。组织分布结果表明，各个基因在血液、眼柄、鳃、胃、肝胰腺、心脏中均有表达，但呈不同的表达模式。PtSP mRNA主要在血细胞、鳃、眼柄中表达，而PtSPH1 mRNA主要在胃中表达。PtcSP1-3和PtcSPH同样在各个组织中呈现出不同的分布模式，PtcSP1、PtcSP2均在在鳃和眼柄中表达量较高，而PtcSP3和PtcSPH在血细胞中表达量最高，提示各个基因在免疫中发挥的重要作用。 在三疣梭子蟹后受到溶藻弧菌、藤黄微球菌、毕赤酵母菌刺激后，，PtSP 在藤黄微球菌刺激后，其表达量仅在刺激后第8小时出现一个较为明显的峰值，在其它时间段表达量相对于对照组有较为轻微的上升；PtSPH1表达量在三种菌后的48小时内均表现出明显的上升，表明PtSPH1对于菌液刺激更为敏感。带有clip domain 的丝氨酸蛋白酶及其同源物中，在三种菌刺激后，PtcSP1-3的表达量均表现出明显上升，表明这三个带有clip domain的丝氨酸蛋白酶均参与到三疣梭子蟹抵御革兰氏阴性菌、革兰氏阴性菌、真菌的免疫反应中；相对于其它两种菌来说，溶藻弧菌刺激后PtcSPH表达量变化最为明显，这些发现均表明带有clip domain的丝氨酸蛋白酶及其同源物在抗菌免疫反应中各自发挥不同的作用。
语种	中文
文献类型	学位论文
条目标识符	http://ir.qdio.ac.cn/handle/337002/17739
专题	实验海洋生物学重点实验室 海洋生物技术研发中心
推荐引用方式 GB/T 7714	李倩倩. 三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）丝氨酸蛋白酶及其同源物的基因克隆和表达分析[D]. 中国科学院研究生院,2012.

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三疣梭子蟹（Portunus tritu（6280KB）			限制开放	CC BY-NC-SA	浏览

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