长牡蛎防御相关基因的进化表达调控分析

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	长牡蛎防御相关基因的进化表达调控分析
	张琳琳
学位类型	博士
导师	张国范
	2012-05-19
学位授予单位	中国科学院研究生院
学位专业	水产养殖
关键词	长牡蛎基因组转录组防御系统表达分化
摘要	潮间带是介于海洋和大陆之间的过渡地带，是潮区最高高潮线至最低低潮线之间的海岸带，包含了沙滩、岩礁、盐沼、河口等多种多样的地理环境，是重要的海洋极端环境。长牡蛎（Crassostrea gigas）是潮间带的典型物种，也是研究海洋生物对潮间带环境适应的极佳模式生物。借鉴海胆和果蝇等模式生物防御相关基因的研究成果，利用长牡蛎基因组序列图谱，EST文库，不同胁迫状态下的转录组等多种功能基因组数据，借助生物信息学的研究方法，我们分析了长牡蛎的防御系统，鉴定了为数众多的防御系统相关基因；并从比较基因组学的角度探讨了该系统关键基因的进化历程；对牡蛎胁迫状态下的防御相关基因表达模式进行了系统的分析。另一方面，本文克隆了防御系统的一些关键基因，并从基因家族分析的角度对它们进行了系统进化研究和表达模式探讨。总之，本研究以高度适应潮间带广温、广盐、缺氧及不稳定环境，且生理生态特殊的长牡蛎为研究对象，从基因组水平和转录组水平上研究潮间带环境适应中关键基因的适应性进化，及其胁迫状态下响应模式。获得的主要结果如下： 1. 长牡蛎基因组进化与防御相关基因利用长牡蛎的基因组序列图谱与物种进化树上的代表种（人，海胆，果蝇，蜜蜂，牡蛎，水蛭，帽贝，小头虫）以及冠轮动物超门的其他测序物种（水蛭，帽贝，小头虫）的基因组序列进行基因家族收缩和扩张的比较分析，发现长牡蛎中扩张的基因家族其功能富集结果偏向于防御相关，富集到的条目包括“凋亡”、“免疫反应”、“防御反应”和“蛋白泛素化”等，提示长牡蛎基因组在进化中积累了相对较多的防御系统基因资源用于适应复杂多变的潮间带环境。另一方面，对不同胁迫状态下的转录组数据分析表明，应激调控基因倾向于为倍增基因，暗示长牡蛎防御相关基因的扩张可能是复制而来。进一步对基因倍增的机制进行深入发掘，发现串联复制可能是长牡蛎基因倍增的重要来源，并且在倍增基因形成的早期即发生表达分化。 2. 长牡蛎防御相关基因本研究利用模式生物相关领域的研究基础和长牡蛎的基因组序列图谱，对长牡蛎的防御系统首次进行了基因组水平上的全面分析，从整体上刻画了长牡蛎的防御系统特征。我们发现长牡蛎的应激防御系统复杂完善，其胞内反应的核心成员热激蛋白HSP70Toll样受体，含C1q结构域蛋白,纤维蛋白原相关蛋白和C型凝集素）也经历了大规模的基因扩增，结合海胆和文昌鱼基因组中发生的类似情况，我们猜测胚系编码的大规模、多类型的免疫识别受体是不具备获得性免疫的无脊椎动物的主要和特征性免疫识别机制。和凋亡抑制蛋白IAP家族发生明显扩张，分别在长牡蛎基因组中有88和48个拷贝。长牡蛎基因组还编码了136个细胞色素氧化酶450（CYP450）基因，在CYPⅡ亚家族存在显着扩张，推测它们可能在抵抗异生物质过程中具有重要作用。此外，典型免疫识别受体（ 3. 基于RNA-seq的不同胁迫状态转录组分析本研究利用RNA-seq测序技术，对长牡蛎的69个胁迫转录组（梯度温度，盐度，不同重金属、不同诱导时间的不同病原，不同时间干露条件）进行比较分析，筛选得到7,440个应激调控基因。相关基因的功能分类显示，胁迫中上调的基因主要有电子传递链基因，核糖体相关蛋白，物质能量代谢相关基因以及稳定蛋白和DNA的相关基因。此外，本文还从差异基因和模块（功能网络，候选相互作用的基因等）的角度进行了不同应激原诱导的应激调控基因的关联性分析，结果显示同一个差异基因或者模块参与不同胁迫条件的调控。胞内应激系统的关键基因如分子伴侣等均在应激状态下大量表达，说明胁迫状态下，胞内应激系统功能全面激活，维持蛋白代谢乃至细胞到生物体的稳态平衡。温度胁迫条件下筛选到表达量下调基因455个，上调基因320个，其中高度诱导的HSP70在35 °C高温胁迫12h时上调高达2,000倍，HSP70的扩张和高温下的高度诱导表达可能与长牡蛎适应潮间带正午曝晒时接近49 °C的高温的能力有关，这些高度诱导表达的HSP70在系统发育树中聚类为一枝，暗示其扩张发生在近期。盐度胁迫筛选到下调基因531个，上调基因492个。渗透物质自由氨基酸（FAA）代谢相关的基因在低盐转录组中显着差异表达，暗示FAA在渗透调控以及低盐胁迫中的重要作用，牡蛎具有高含量的FAA，可能是其适应潮间带降雨或河口所致低盐的重要原因；重金属胁迫筛选到下调基因1,095个，上调基因 605个，金属硫蛋白（MT）在镉和汞胁迫下高表达，暗示MT可能是长牡蛎能够耐受高负荷重金属的重要原因；此外，本文还筛选到弧菌诱导差异基因829个，帕金虫诱导差异基因494个，这些基因为研究长牡蛎能够耐受高病原负荷的机制提供了基础资源；最后，干露胁迫条件下筛选到下调基因1,974个，上调基因2,445个。二维聚类结果暗示，闭壳肌和鳃在干露胁迫的应对中有不同的分工，闭壳肌作为糖原的储存场所，在干露的基因应激表达以及调控中发挥更重要作用。IAP在干露条件下高表达，其中高度诱导的5个IAP基因在干露状态闭壳肌中上调66倍，结合IAP抑制凋亡酶的功能机制，我们猜测IAP的扩张及其高度诱导表达可能是长牡蛎适应潮间带长时间露空的重要组学基础。 4. 长牡蛎TLR信号传导通路 TLR信号传导通路是免疫反应中的古老通路和基本成分。本文从cDNA和gDNA水平克隆了CgToll-1基因，并调查了CgToll-1在不同器官和弧菌诱导下的表达模式，为长牡蛎免疫反应研究提供了基础资料。在此基础上，本文寻找了贝类中TLR通路的关键基因，并将之与海葵，线虫，果蝇和海胆在系统发育树，蛋白比对，密码子使用偏向性方面进行了比较分析，结果表明TLR信号通路下游的基因比上游的基因更具有保守性。 5. 长牡蛎凋亡调控网络凋亡系统在防御系统和生长发育中起到重要作用，但在贝类中研究较少，本文利用长牡蛎EST库和基因组序列对凋亡系统关键基因进行鉴定，发现凋亡系统的主要基因在牡蛎中是保守的，IAP和凋亡酶在长牡蛎基因组中发生了扩张。另外，本研究还克隆了四个凋亡关键基因CgFADD, CgIAP, CgCaspase-1和CgCaspase-2，对上述基因进行了系统进化和诱导表达分析。结果表明，凋亡系统在生物应对胁迫时基因表达模式差异明显，在应激反应中有不可替代的重要作用。
语种	中文
文献类型	学位论文
条目标识符	http://ir.qdio.ac.cn/handle/337002/17727
专题	海洋生物技术研发中心
推荐引用方式 GB/T 7714	张琳琳. 长牡蛎防御相关基因的进化表达调控分析[D]. 中国科学院研究生院,2012.

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