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长牡蛎(Crassostrea gigas) TLR和RLR信号通路的免疫功能研究
杜以帅
学位类型博士
导师张国范
2013
学位授予单位中国科学院研究生院
学位专业海洋生物学
关键词长牡蛎 牡蛎疱疹病毒 天然免疫研究
摘要牡蛎是我国乃至世界重要的海水养殖品种,自1972年在美洲牡蛎中发现了疱疹样病毒,到目前为止,全世界范围内多种双壳贝类中已经检测到牡蛎疱疹病毒-1(Oyster Herpesvirus-1, OsHV-1),并且OsHV-1已被证明与幼虫的大规模死亡有关,在繁育季节幼虫的大规模死亡也为养殖业带来了巨大的经济损失。目前国内外关于牡蛎对OsHV-1的免疫机制的研究还处于一片空白之中,并且对OsHV-1引起的贝类的死亡和病害没有十分有效的解决办法,严重影响了牡蛎养殖业的健康和可持续发展。因此研究牡蛎对OsHV-1的天然免疫反应,从牡蛎机体本身研究其对OsHV-1的免疫防御机制,为预防OsHV-1引起的死亡和病害提供理论基础,也为减少养殖业的的损失提供有力帮助。 本研究以长牡蛎(Crassostrea gigas)为研究对象,利用细胞生物学,生物信息学、分子生物学和免疫学等手段,对长牡蛎幼虫和幼贝对OsHV-1的天然免疫反应进行了系统研究,获得的结果如下: TLRs与RLRs是天然免疫防御中重要的模式识别受体(Pattern recognition receptor,PRR),通过RACE技术从长牡蛎中克隆得到了其所属的TLR和RLR信号通路中的关键基因cDNA全长,其中TLR信号通路包括4个TLR基因(分别命名为Cg05421 TLR、Cg17269 TLR、Cg21740 TLR和Cg27513 TLR)和2个接头分子MyD88 (Myeloid differentiation primary response gene 88)基因(分别命名为CgMyD88-1和CgMyD88-2),RLR信号通路包括11个RIG-I (Retinoic acid-inducible gene-I)基因(命名为RIG-I-1到RIG-I-11)和一个接头分子MAVS基因(命名为CgMAVS),除此之外还得到了TRAF基因(TNF receptor associated factor)(命名为CgTRAF2和CgTRAF6)和IRF基因(Interferon regutory facror)(命名为Cg07268 IRF、Cg07269 IRF和Cg16646 IRF)完整的ORF序列。通过SMART结构域分析,发现这些基因大部分具有与脊椎动物同源基因相似的结构域特征,并且氨基酸序列具有一定的相似性,并通过构建进化树分析了这些基因在不同物中的进化地位。 通过对长牡蛎生长发育表达谱数据进行cluster分析,挑选表达稳定的cluster中并且与人类管家基因同源的9个基因与长牡蛎中常用的内参基因18S rRNA (18S), 28 rRNA (28S), elongation factor-1 (EF-1α), β-actin (ACT) 和 glyceraldehyde-3 phosphate-dehydrogenase (GAPDH)共同作为候选内参基因,通过qRT-PCR(Quantitative real time PCR)技术和GeNORM软件分析在被OsHV-1感染的幼虫样品和未被OsHV-1感染的幼虫样品中进行内参基因的筛选,结果表明核糖体蛋白基因RL7与RS18是最适合作为长牡蛎D型幼虫时期和壳顶幼虫时期qRT-PCR的内参基因。在获得最佳内参基因基础上,对4个TLR基因和9个RIG-I基因在OsHV-1攻毒前后的长牡蛎幼虫样品中,通过qRT-PCR的方法研究其mRNA的相对表达量变化,结果表明:3个TLR基因在OsHV-1攻毒后壳顶期U2出现峰值,一个TLR基因和9个RIG-I基因都在壳顶期U5出现峰值。针对这些结果提出一个假说:三个TLR基因(Cg05421 TLR、Cg17269 TLR和Cg21740 TLR)参与牡蛎幼虫对OsHV-1的识别或者介导OsHV-1进入牡蛎细胞的细胞膜过程,其蛋白质应该定位在细胞膜上;Cg27513 TLR基因和RIG-I基因参与识别OsHV-1进入牡蛎细胞后自身复制产生的中间产物(DNA或者RNA),其蛋白质定位应该在细胞质内。采用EGFP融合蛋白的方法做了4个TLR基因的亚细胞定位实验对这个假说进行验证,结果表明4个TLR基因均定位于细胞质与内涵体中,虽然与假说不符,但是长牡蛎中TLR基因定位于内涵体中发挥作用是国际上的首次报道。另外两个MyD88基因CgMyD88-1与CgMyD88-2均定位于细胞质内与其生物学功能相称。 为了进一步验证TLR与RLR通路关键基因对OsHV-1的免疫防御作用,将含有OsHV-1的上清液攻毒长牡蛎幼贝。TLR通路中TLR基因与MyD88基因均可被OsHV-1诱导上调并且在一些时间点与对照形成显著性差异(p < 0.05),并且通过酵母双杂交实验发现Cg27513 TLR的TIR结构域与CgMyD88-2存在蛋白质相互作用,这些结果表明长牡蛎中存在参与OsHV-1免疫的依赖MyD88的TLR信号通路;RLR通路中RIG-I基因与MAVS基因和TRAF与IRF基因也可被OsHV-1诱导上调并且在一些时间点与对照形成显著性差异(p < 0.05),并且进一步在长牡蛎中建立了以siRNA为介质的RNA干扰技术,在将MAVS干扰后发现CgTRAF2与CgTRAF6、Cg07268 IRF、Cg07269 IRF和Cg16646 IRF与MAVS抑制表达模式相似,推测CgTRAF2与CgTRAF6、Cg07268 IRF、Cg07269 IRF和Cg16646 IRF可能位于RLR通路。在MAVS干扰后的攻毒实验结果中,实验组长牡蛎的累积死亡率明显高于正常组和阴性组,说明MAVS在抗OsHV-1的天然免疫中发挥重要作用。这些结果表明长牡蛎中存在MAVS参与的RLR信号通路,并且RLR通路参与OsHV-1的免疫防御作用。 综上所述,本研究确定了长牡蛎中存在依赖MyD88的TLR信号通路和MAVS参与的RLR信号通路,并且这两个通路都参与OsHV-1的天然免疫反应,对长牡蛎抗OsHV-1的侵染机制中起着至关重要的作用。
语种中文
文献类型学位论文
条目标识符http://ir.qdio.ac.cn/handle/337002/17725
专题海洋生物技术研发中心
推荐引用方式
GB/T 7714
杜以帅. 长牡蛎(Crassostrea gigas) TLR和RLR信号通路的免疫功能研究[D]. 中国科学院研究生院,2013.
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