实验海洋生物学重点实验室知识库

近年来，牡蛎大规模死亡事件频发，逐渐成为制约其养殖的关键限制因素。目前牡蛎大规模死亡的原因尚不明确，但普遍认为是牡蛎自身的免疫防御机制与外界环境、病原等综合作用的结果。Toll样受体（TLR，Toll like receptor）是一类重要的模式识别受体（Pattern recognition receptor，PRR），可识别不同病原，引发宿主免疫应答反应。本文通过对比较感染转录组，基因家族系统发育和分子演化机制三个方面的研究，试图揭示牡蛎TLRs的分子演化历程、机制及在免疫防御中的意义，继而为牡蛎病害防治提供理论支撑。

帕金虫病是导致美洲牡蛎（Crassostrea virginica）大规模死亡的一种典型寄生虫疾病，但它的近缘物种长牡蛎（C. gigas）对帕金虫并不敏感。我们通过比较感染转录组探索了两种牡蛎在帕金虫感染前后的基因表达模式。首先，研究发现美洲牡蛎帕金虫感染后天然免疫反应比长牡蛎更为显著。其次，美洲牡蛎中天然系统中具有独特的天然免疫系统基因，如含有四个CRD结构域的天然免疫识别受体半乳糖凝集素，这可能与帕金虫病原的特异性识别相关。此外，两种牡蛎天然免疫系统的环境选择压力不同。美洲牡蛎帕金虫诱导型TLR基因受到显著的正选择，而长牡蛎中并未检测到，这暗示着TLR基因的演化可能在对两种牡蛎帕金虫易感性差异中具有重要意义。

为了明晰牡蛎TLRs的分子演化历程，本文从系统演化的角度入手，借助已发布的32个位于系统演化树不同节点物种的基因组，探究了TLR及MyD88两个基因家族的系统发育关系。我们发现海洋贝类中TLR和MyD88基因家族呈现显著的扩张模式，且不同类群中为谱系特异性的扩张。此外，多数双壳贝类特异性扩张的TLR基因能够被病原诱导表达，且在不同病原感染时具有特异性的表达模式。这些结果表明，牡蛎TLRs及MyD88s可能通过基因复制和复制后的功能分化形成了复杂的、特异的信号传导通路。

最后，本文分析了牡蛎TLR复制和假基因化等分子演化模式。通过计算TLR受体倍增基因对的序列分化时间参数Ks值，发现两种牡蛎TLRs演化历程中均发生了两次集中的复制事件，表明串联重复驱动的基因倍增可能是牡蛎基因组中TLR扩张的重要分子机制。此外，研究检测到TLRs复制后的新基因存在移码突变、提前终止等现象导致的部分功能缺失，成为TLR-like基因，且部分TLR-like基因能够表达。TLR-like基因在牡蛎天然免疫应答中的功能有待今后的研究。

综上所述，本文以牡蛎为研究对象，探索TLR基因的分子演化及其在免疫防御中的意义。结果表明，正选择、快速扩张和功能分化是牡蛎TLR基因快速演化的主要机制。TLR基因的适应性演化在牡蛎免疫防御中起到重要作用。这些结果丰富了牡蛎的天然免疫识别受体研究，有助于深入了解海洋贝类的天然免疫防御系统，也为水产贝类病害防治和牡蛎养殖业的健康发展提供理论支撑。

第1章 绪论

1.1 牡蛎病害

1.1.1 帕金虫病

1.1.2 应对病害的分子调控机制

1.2 牡蛎免疫系统

1.2.1 细胞免疫

1.2.2 体液免疫

1.3 牡蛎免疫系统研究的生态学意义

1.4 牡蛎免疫系统的研究进展

1.4.1 免疫识别

1.4.2 免疫应答

1.5 Toll样受体信号通路

1.6 TLR信号通路研究现状

1.7 研究目的与意义

1.7.1 研究目的

1.7.2 研究意义

第2章 美洲牡蛎和长牡蛎帕金虫感染的比较转录组研究

2.1 前言

2.1材料和方法

2.1.1牡蛎的帕金虫感染实验

2.1.2 转录组数据分析

2.1.3 美洲牡蛎和长牡蛎之间的直系同源基因鉴定

2.1.4 基因注释

2.1.5 系统发育分析

2.1.6 美洲牡蛎帕金虫感染后的微列阵基因表达数据下载

2.2 结果

2.2.1 牡蛎基因组天然免疫相关基因注释

2.2.2 美洲牡蛎响应帕金虫感染的转录组表达谱分析

2.2.3 美洲牡蛎和长牡蛎帕金虫感染的比较转录组分析

2.2.4 与微列阵芯片实验的一致性验证

2.2.5 两种牡蛎直系同源基因帕金虫感染下的基因表达模式

2.2.6 长牡蛎和美洲牡蛎半乳糖凝集素的序列和诱导表达模式

2.2.7 TLR的分子进化和基因表达比较

2.2.8 FBGDC的谱系特异性扩张和功能分化

2.2.9 C1qDC的谱系特异性扩张和功能分化

2.3 讨论

2.3.1 美洲牡蛎和长牡蛎转录组表达差异

2.3.2 宿主-病原互作反应

2.3.3 宿主防御中的正选择作用

2.3.4 未来展望

第3章 海洋贝类Toll样受体及其接头分子MyD88的系统发育研究

3.1 前言

3.1 材料与方法

3.1.1 基因组下载与TLR基因鉴定

3.1.2 系统发育分析

3.1.3 转录表达分析

3.2结果

3.2.1 海洋贝类TLR信号通路关键分子的显著扩张

3.2.2 软体动物TLRs的系统演化

3.2.3 软体动物MyD88s的系统演化

3.2.4长牡蛎TLRs在胁迫环境以及早期发育时期的基因表达模式

3.2.5长牡蛎MyD88s在胁迫环境以及早期发育时期的基因表达模式

3.3 讨论

3.3.1 TLR通路在海洋贝类中的显著扩张

3.3.2 海洋贝类TLRs和MyD88s扩张起源

3.3.3 TLRs和MyD88s功能演化研究

第4章 牡蛎Toll样受体的分子演化

4.1 前言

4.1 材料方法

4.1.1 牡蛎TLR基因家族序列的获取

4.1.2 鉴定TLR-like基因

4.1.3 TLR-like基因的移码突变分析

4.1.4 倍增基因的分化年龄计算

4.1.5 本章涉及的转录组数据资源

4.2 结果

4.2.1 牡蛎TLR分子演化的整体模式

4.2.1 牡蛎TLR-like基因中的移码突变

4.2.3 牡蛎TLR及TLR-like倍增基因分布

4.2.4 牡蛎TLR及TLR-like的串联重复现象

4.2.5 牡蛎TLR及TLR-like基因在不同胁迫下的免疫应答

4.3 讨论

4.3.1 TLR新基因的获得

4.3.2 扩张中TLR-like基因的普遍性

4.3.3 TLR及TLR-like基因串联复制

第5章 总结

参考文献

致谢

作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果