实验海洋生物学重点实验室知识库

紫菜属红藻门红毛菜科，是目前经济价值最高的经济海藻，我国紫菜产量较高，同日本、韩国并列为世界三大紫菜养殖国。目前紫菜加工行业整体水平较低，紫菜的主要利用途径是通过简单地干燥后制成休闲食品供直接食用，精深加工产品较少。后期紫菜因口感较差导致售价较低，属于低值紫菜。研究表明低值紫菜蛋白质、多糖含量较高，但是目前这些活性物质没有得到充分应用，因此开展对低值紫菜的深加工和综合利用尤为重要。本文以条斑紫菜为研究对象，分别建立了蛋白、多肽、寡糖的制备方法并对其应用潜力及生物活性进行评价。主要研究结果如下：
1、先后使用室温水提、碱提的方法获得紫菜水提物(WSC)和紫菜碱提物(ASC)，得率分别为8.01± 0.61%和11.71± 0.84%。通过化学组成分析、红外、热重和差示扫描量热法对其理化性质进行表征，结果表明多糖是WSC的主要成分(54.61± 0.86%)，ASC蛋白较多(69.68± 0.08%)，WSC和ASC单糖组成都以半乳糖为主，热稳定性良好。对上述提取物的氮溶解度、持水性、持油性、起泡性、乳化性等功能性质测定显示，WSC的乳化活性和持油能力均高于ASC。ASC具有较高的氮溶解度、持水性和发泡性。此外WSC和ASC还具有一定的体外抗氧化能力，表明紫菜提取物在食品加工中具有良好的应用前景。
2、通过复合酶解法和酸解法分别制备了条斑紫菜酶解物(PYE)和条斑紫菜寡糖(OP)，并对PYE和OP的化学组成和免疫活性进行了测定。PYE主要含有多肽(48.18± 0.22%)、多糖(17.72± 0.16%)、少量无机盐(9.87%)和游离氨基酸(5.42%)。OP是以半乳糖为主的寡糖(54.05± 2.52%)，重均分子量为1421 Da。PYE和OP分子量较低，水解较充分，更有利于动物的消化和吸收。
细胞毒性试验显示，25~800 μg/mL浓度下的PYE和25~400 μg/mL浓度下的OP对RAW264.7细胞没有表现出细胞毒性。当PYE浓度大于200 μg/mL时，对RAW264.7表现出免疫刺激活性，且呈明显的剂量依赖性。OP浓度大于 100 μg/mL时在LPS诱导的RAW264.7细胞模型表现出了显著的免疫抑制活性，且呈剂量依赖。
分别制备了含有PYE和OP的水产饲料，添加剂量为0.1%、1%、2%，并进行了斑马鱼饲喂实验。对不同组别的斑马鱼的生长指标、体成分、消化酶活性、免疫因子的含量以及肠道菌群进行了测定。在生长指标方面，PYE 1%、2%添加组在增重、特定生长率等指标上显示出了一定的促进作用，但未表现出显著性差异，饲料中OP的添加没有影响斑马鱼的生长指标。PYE和OP均能够有效的促进鱼体粗蛋白的积累，且表现出了增强淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶活性的作用。免疫调节活性研究结果表明，PYE和OP均能够调节肠道免疫因子，饲料中PYE的添加增加了溶菌酶、白介素-10的含量，减少了肿瘤坏死因子α的含量；OP能够上调肿瘤坏死因子-α和白介素-10的含量，对溶菌酶含量没有影响，表明OP和PYE对斑马鱼具有免疫调节作用。肠道菌群分析显示，饲料中添加1% OP能够显著改变肠道菌群物种组成。1% OP添加组肠道菌群中放线菌门丰度升高，变形菌门丰度降低。饲料中PYE的添加并未对斑马鱼肠道菌群造成显著影响。因此紫菜酶解物和紫菜寡糖对斑马鱼具有良好促生长和免疫调节作用，具有用作水产饲料添加剂的潜力。

第一章 引 言 .......................................................................................... 1
1.1 1.1 紫菜的研究概况 ................................ ................................ .......................... 1
1.1.1 紫菜简介 ............................................................................................ 1
1.1.2 紫菜的营养成分研究进展 ................................................................ 1
1.2 1.2 藻类蛋白在食品中应用研究现状 ................................ .............................. 7
1.2.1 藻类蛋白的提取 ................................................................................ 8
1.2.2 藻类蛋白的活性 ................................................................................ 9
1.2.3 藻类蛋白在食品加工中的功能性质 ................................................ 9
1.3 1.3 藻类在水产养殖饲料中应用研究现状 ................................ .................... 10
1.4 1.4 研究目的与意义 ................................ ................................ ........................ 11
第二章 条斑紫菜提取物的制备、表征、功能性质及抗氧化活性评价 .............................................................................................................. 13
2.1 2.1 仪器与材料 ................................ ................................ ................................ 13
2.1.1 实验仪器 .......................................................................................... 13
2.1.2 实验材料 .......................................................................................... 14
2.1.3 实验试剂 .......................................................................................... 14
2.2 2.2 实验方法 ................................ ................................ ................................ .... 15
2.2.1 条斑紫菜水提物和碱提物的制备 .................................................. 15
2.2.2 化学组成分析 .................................................................................. 16
2.2.3 热稳定性分析 .................................................................................. 18
2.2.4 功能性质的测定 .............................................................................. 18
2.2.5 抗氧化能力的测定 .......................................................................... 19
2.3 2.3 实验结果 ................................ ................................ ................................ .... 19
2.3.1 紫菜水提物、碱提物的化学成分分析 .......................................... 19
2.3.3 红外光谱分析 .................................................................................. 21
2.3.4 热稳定性分析 .................................................................................. 22

2.3.5 功能性质 .......................................................................................... 23
2.3.6 体外抗氧化活性 .............................................................................. 27
2.4 2.4 讨论 ................................ ................................ ................................ ............ 28
第三章 条斑紫菜酶解物、寡糖的制备、组成及免疫活性评价 ...... 31
3.1 3.1 实验仪器与材料 ................................ ................................ ........................ 31
3.1.1 实验仪器 .......................................................................................... 31
3.1.2 实验材料 .......................................................................................... 31
3.1.3 实验试剂 .......................................................................................... 31
3.2 3.2 实验方法 ................................ ................................ ................................ .... 32
3.2.1 条斑紫菜寡糖的制备 ...................................................................... 32
3.2.2 条斑紫菜寡糖聚合度测定 .............................................................. 33
3.2.3 条斑紫菜酶解物的制备 .................................................................. 33
3.2.4 条斑紫菜酶解物化学组成的测定 .................................................. 34
3.2.5 细胞毒性试验 .................................................................................. 34
3.2.6 NO测定 ........................................................................................... 35
3.3 3.3 实验结果 ................................ ................................ ................................ .... 35
3.3.1 紫菜酶解物、寡糖的化学组成 ...................................................... 35
3.3.2 条斑紫菜酶解物在细胞水平的免疫活性 ...................................... 36
3.4 3.4 讨论 ................................ ................................ ................................ ............ 39
第四章 条斑紫菜酶解物、寡糖促进斑马鱼生长和免疫调节的活性评价 .......................................................................................................... 41
4.1 4.1 实验仪器与材料 ................................ ................................ ........................ 41
4.1.1 实验仪器 .......................................................................................... 41
4.1.2 实验材料 .......................................................................................... 41
4.1.3 实验试剂 .......................................................................................... 41
4.2 4.2 实验方法 ................................ ................................ ................................ .... 43
4.2.1 饲料的制备 ...................................................................................... 43
4.2.2 实验用斑马鱼的养殖 ...................................................................... 43
4.2.3 样品采集和生长指标的测定 .......................................................... 43
4.2.4 体成分的测定 .................................................................................. 44

4.2.5 消化酶活性的测定 .......................................................................... 44
4.2.6 荧光定量PCR测定目的基因表达 .................................................... ...................................................................................................................... 44
4.2.7 ELISA检测炎症因子含量 ............................................................. 45
4.2.8 HE染色 ........................................................................................... 46
4.2.9 肠道菌群测定 .................................................................................. 46
4.3 4.3 实验结果 ................................ ................................ ................................ .... 46
4.3.1 饲料中添加条斑紫菜酶解物、寡糖对斑马鱼生长的影响 .......... 46
4.3.2 饲料中添加条斑紫菜酶解物、寡糖对斑马鱼消化酶活性的影响 ...................................................................................................................... 49
4.3.3 饲料中添加条斑紫菜酶解物、寡糖对斑马鱼免疫功能的影响 .. 50
4.3.4 饲料中添加条斑紫菜寡糖对斑马鱼肝脏、肠道的影响 .............. 50
4.3.5 饲料中添加条斑紫菜酶解物、寡糖对斑马鱼肠道菌群的影响 .. 51
4.4 4.4 讨论 ................................ ................................ ................................ ............ 56
第五章 结论与展望 .............................................................................. 59
参考文献 .................................................................................................. 61
致 谢 ........................................................................................................ 73
作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 ...................... 74