实验海洋生物学重点实验室知识库

细菌胞外多聚物是是指附着在细菌表面或围绕在细菌周围的天然有机物，主要由多糖，蛋白质，核酸，磷脂以及无机盐组成。胞外多聚物在细菌的营养获取、定植生长、信息交流、耐药性、抗环境胁迫等方面发挥着重要作用。可以说，胞外多聚物是细菌赖以生存的关键结构之一。另外，由于细菌胞外多聚物普遍存在多糖成分，所以细菌胞外多聚物也被认为是潜在的天然多糖来源。部分胞外多糖如黄原胶、结冷胶、右旋糖酐等在带来巨大市场收益的同时，在生物医疗领域的前景也被寄予厚望。已有研究证实，细菌源胞外多糖具有抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、抗病毒等活性。同动植物来源多糖相比，细菌源胞外多糖具有显著的优势，可以借助发酵工程来批量获得产品，还可以调控代谢途径来实现结构修饰。海洋中的高盐高压等极端条件是原核生物，特别是细菌生存的巨大挑战，这意味着海洋细菌进化出了独特的代谢方式，影响了胞外多聚物的结构，是发现新颖活性和结构的天然多糖的重要途径。
本实验从南海北部海域分离到了97株可培养细菌，添加蔗糖作为碳源小体积发酵后，使用醇沉水溶的方法得到细菌胞外多聚物。采用H2O2损伤的SH-SY5Y细胞模型筛选具有神经保护活性的胞外多聚物，并完成了活性多聚物的组成分析和活性菌株的分子生物学鉴定，构建系统进化树比较活性菌的分类地位。结果证明：97株细菌中有16株的胞外聚合物具有神经保护活性，800 μg/mL的胞外聚合物干预后能使SH-SY5Y的细胞活力从损伤组的67上升至实验组的90以上。活性胞外聚合物的成分分析发现总糖和蛋白含量接近，总糖含量在14.06~21.40之间，蛋白含量在10.66~31.05之间，硫酸基含量在2.91~26.53之间。多糖成分的单糖组成也比较相似，主要集中在六种单糖：Man、GlcN、GlcA、GalN、Glc、Gal，部分存在Fuc和Rha。基于16S rDNA结果可以确定16株活性菌主要分布在3个门类（厚壁菌门，变形菌门和放线菌门），8科（Bacillaceae，Planococcaceae；Halomonadaceae，Alteromonadaceae，Phyllobacteriaceae，Pseudomonadaceae，Stenotrophomonas），9属16种。在种的分类地位上，有8株不同的芽孢杆菌和2株不同的盐单胞菌。
体外实验确定Bacillus sp. H5的胞外多聚物的免疫刺激活性较好，批量发酵脱蛋白后制得了胞外多糖，经过层析分离得到四个组分：EPS5SH，EPS5SL，EPS5-2和EPS5-6。四个组分中EPS5SH的总糖含量最高，达到64.7%，其余组分低于10%。EPS5SH的分子量为89.0 kDa，甘露糖、氨基葡萄糖、葡萄糖、半乳糖的摩尔比为1.00: 0.02: 0.07: 0.02。基于红外、核磁共振确定EPS5SH为α甘露聚糖，结合甲基化分析和电喷雾质谱分析表明EPS5SH具有α-(1→4)-Manp、α-(1→3)-Manp或α-(1→2)-Manp和α-(1→2, 4)-Manp。EPS5SH表现出显著的免疫刺激活性，能够显著上调RAW264.7中iNOS的表达，呈剂量依赖性地促进NO释放。ELISA实验证实，EPS5SH在100，200 μg/mL的剂量下显著刺激RAW264.7释放炎症因子，包括TNF-α，IL-1β和IL-6。Western blot实验表明细胞表面TLR4参与了激活巨噬细胞过程，进而上调NF-κB和MAPK信号通路节点蛋白的磷酸化水平来实现免疫刺激作用。综上所述，EPS5SH是一种新颖的免疫刺激甘露聚糖。

第一章 引言... 1

1.1 海洋细菌资源的开发与研究. 1

1.2 海洋细菌胞外多聚物的研究进展. 2

1.2.1 胞外多聚物的意义... 2

1.2.2 胞外多聚物及胞外多糖（exopolysaccaride，EPS）的制备... 3

1.2.3 胞外多糖的性质... 5

1.2.4 胞外多糖的应用... 7

1.2.5 胞外多糖的优越性... 11

1.3 研究目的与意义. 12

第二章 细菌胞外多聚物的神经保护活性筛选和活性菌的多样性研究 13

2.1 实验材料. 13

2.1.1 实验生物... 13

2.1.2 培养基... 13

2.1.3 实验试剂... 14

2.1.4 实验仪器... 15

2.2 实验方法. 15

2.2.1 菌株发酵制备胞外多聚物... 15

2.2.2 过氧化氢损伤剂量的确定... 16

2.2.3 胞外多聚物体外神经保护活性的筛选... 16

2.2.4 胞外聚合物的化学成分分析... 17

2.2.5 活性菌株鉴定及保藏... 18

2.3 实验结果. 18

2.3.1 深海细菌胞外多聚物体外神经保护活性筛选... 18

2.3.2 胞外多聚物的化学性质分析... 20

2.3.4 种属鉴定结果... 22

2.3.3 系统发育树分析... 24

2.4 讨论. 24

第三章 一株海洋芽孢杆菌胞外多糖的分离纯化及生物活性评价... 27

3.1 实验仪器与材料. 27

3.1.1 实验仪器... 27

3.1.2 实验材料... 28

3.1.3 实验试剂... 28

3.2 实验方法. 28

3.2.1 胞外多糖的发酵批量制备... 28

3.2.2 EPS的分离纯化... 29

3.2.3 纯化组份神经保护活性验证... 29

3.2.4 纯化组份免疫调节活性验证... 29

3.2.5 纯化组份结构表征... 31

3.3 实验结果. 33

3.3.1 EPS粗产物制备... 33

3.3.2 EPS的分离纯化... 34

3.3.3 EPS分子量和单糖组成... 36

3.3.4 EPS纯化组分红外光谱... 37

3.3.5 串联MS/MS和GC-MS分析... 38

3.3.6 核磁共振分析... 43

3.3.7 EPS5纯化组分对SH-SY5Y细胞的神经保护能力评价... 43

3.3.8 EPS5SH对RAW264.7细胞的细胞毒性研究... 44

3.3.9 EPS5SH对炎症介质分泌的影响... 45

3.3.10 EPS5SH对NF-κB和MAPK信号通路的影响... 47

3.3.11 EPS5SH对RAW264.7表面受体的影响... 48

3.4 讨论. 48

第四章 结论与展望... 51

参考文献... 53

致 谢... 73

作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 75