实验海洋生物学重点实验室知识库

动物的性别决定与性别分化一直是生物学家关注的热点问题。有关性别决定和性别分化机制的研究，在多种脊椎动物和一些模式无脊椎动物中进展较快，已经鉴定了性别决定基因及其调控的下游性别分化因子，为阐释动物性别决定和性别分化的机制奠定了重要基础。甲壳动物作为动物界的一个较大类群，其中包含了许多有重要经济价值的动物，由于其生长性状具有显著的性别二态性，所以，对甲壳动物性别决定和性别分化的研究，不但能丰富其性别决定的理论知识，同时对培育具有产业应用前景的单性品种具有重要意义。性别连锁标记的开发是开展性别决定和性别分化研究的基础，而性别决定基因的发掘是阐释性别决定机制的关键。本论文以世界重要的水产养殖种类——凡纳滨对虾为研究对象，在前期鉴定的性别连锁标记的基础上，对性别决定区域的结构特征进行了研究，并通过全基因组关联（GWAS）分析，获得了多个性别连锁标记；建立了对虾发育早期胚胎和幼体的雌雄差异转录组，获得了胚胎或幼体的雌雄差异表达基因，结合其在性别决定区域的定位，鉴定到了1个性别决定候选基因，为进一步解析凡纳滨对虾的性别决定机制奠定了重要基础。主要进展如下：

1.凡纳滨对虾性别决定区域的结构特征分析及性别连锁标记的开发。通过对已有性别连锁标记序列的延伸和基于全基因组重测序数据的GWAS分析，对性别决定区域进行了精细分析。将凡纳滨对虾性别连锁标记Marker19299所在序列与基因组测序的contig数据进行比对，获得了两条contigs（contig 122401和contig 4497889），根据contig序列设计引物，在雌性中扩增获得了长度为2630 bp的DNA序列，其位于性别决定区域内。在雌雄个体中扩增该序列时，发现其在contig 122401段存在明显的扩增差异，即在雌性中扩增的亮度显著高于雄性，进一步对contig 122401在基因组中的拷贝数进行分析，发现其在雌性基因组中的拷贝数显著高于雄性；在contig 4497889上，雌雄个体中存在明显的序列差异，雌性比雄性多了一段9 bp插入序列及一段205 bp重复序列，说明雌雄个体在性别决定区域存在明显的差异。基于对对虾性别决定区域的特征分析，开发了一种简便快速的在分子水平上鉴定凡纳滨对虾遗传性别的技术，仅通过PCR扩增与琼脂糖凝胶电泳实现对虾性别的遗传鉴定。同时，基于全基因组重测序数据分析，新鉴定发现了5个性别完全连锁标记，这些标记位于4个scaffolds上，在雌性个体中均为杂合型，在雄性个体中均为纯合型，进一步支持了凡纳滨对虾性别决定类型为ZZ/ZW型。研究结果不仅首次提出对虾性别决定区域在雌雄个体中存在DNA结构差异，也为鉴定性别决定基因奠定了重要基础。

2.凡纳滨对虾早期胚胎及幼体雌雄差异微量转录组的建立。首先开发了一种对虾单个胚胎或幼体的DNA/RNA共提取技术，在利用性别探针实现性别鉴定的基础上，将雌雄胚胎的RNA分别混合，用于微量转录组测序。利用该技术成功建立了凡纳滨对虾重要的性别发育时期——溞状幼体I期（Zoea I）的雌雄差异转录组，通过分析转录组数据，获得了60条雌雄差异表达基因DEGs，这些基因可能参与了对虾早期的性别决定和性别发育过程。分析了模式无脊椎动物中已报道的经典性别决定基因在Zoea I期的表达模式，结果显示无雌雄表达差异，说明这些基因可能不参与对虾的性别决定或性别分化过程。利用转录组数据，通过集群分离（BSR）分析得到了一些候选性别连锁基因与SNPs，在凡纳滨对虾不同群体中进行验证，发现位于Unigene0020898与Unigene0020336上的SNPs与性别完全连锁，说明这两个基因位于性别决定区域内。利用早期幼体的雌雄鉴别技术和微量转录组构建技术，进一步建立了从对虾胚胎的肢芽期到仔虾期共计7个时期胚胎和幼体的雌雄差异转录组，这是首次关于对虾发育早期幼体雌雄差异转录组的报道，将为深入研究其性别决定与性别分化机制提供重要的技术与数据支撑。

3.凡纳滨对虾Fem-1基因家族的分子特征及表达分析。在凡纳滨对虾溞状幼体Ⅲ期（Zoea Ⅲ）的雌雄差异转录组中，发现了与线虫性别决定基因CeFem-1同源的基因LvFem-1c，其在雌性个体中呈现高表达水平。进一步对凡纳滨对虾Fem-1基因家族进行了序列分析，发现除LvFem-1c外，还找到了另外两条序列LvFem-1a与LvFem-1b，它们包含8-9个ANK结构域。系统发育分析表明，LvFem-1家族与中华绒螯蟹EsFem-1家族的同源性最高。LvFem-1家族在凡纳滨对虾幼虾、次成体及成体的性腺中均呈现出雌雄差异表达，提示该基因家族在凡纳滨对虾的性别发育过程中可能发挥了较为保守的作用。

4.凡纳滨对虾候选性别决定与分化基因的功能分析。在以上获得的性别决定区域内发现了一个新的基因c131213，该基因在性腺中显示雌雄差异表达，且几乎为卵巢特异表达。c131213有两种剪接类型，均在卵巢发育早期开始表达，并贯穿了整个卵巢发育过程，提示该基因在卵巢发育中可能发挥作用。在胚胎及幼体的雌雄差异转录组中，鉴定发现了一个新的基因Unigene0018354，该基因自胚胎的肢芽期开始，仅在雌性中表达，推测该时期也许是性别决定或者分化的重要时期，自肢芽期后至成虾，该基因均为雌性特异表达，且成虾不同组织表达分析显示，该基因在雌性卵巢中高表达，说明该基因很可能在对虾性别决定和分化过程中发挥着重要作用。通过建立幼体期的RNA干扰技术，目前正在对该基因的功能进行深入分析。