实验海洋生物学重点实验室知识库

潮间带海域是海洋与陆地的交汇区，受到来自海洋、陆地和大气中多种环境因素的影响，使得潮间带海域具有高变异性和敏感性。牡蛎是潮间带代表性生物，有典型的生物学特征，具有重要的生态和经济价值。由于过度捕捞，局部地区环境恶化、环境骤变等因素，导致牡蛎自然种群资源发生衰退，且养殖过程中也存在大规模死亡的现象。因此，研究牡蛎的潮间带适应机制不但对深入了解海洋生物环境适应具有重要的科学价值，同时对解决牡蛎夏季大规模死亡这一产业难题具有现实意义。

遗传分化与表型可塑性是适应性进化的两种重要形式。表型可塑性（Phenotypic plasticity）是个体层面上给定的基因型在应对环境变化过程中进行表型适应的能力，即同一基因型的个体在不同环境中表现出不同表型的能力。已有的研究表明，表型可塑性在牡蛎等海洋变温动物的环境适应过程中发挥重要作用，其中DNA甲基化等表观遗传修饰是调控表型可塑性、介导快速环境响应的重要机制。牡蛎外部特征很容易受到生长环境的影响，潮间带牡蛎与潮下带牡蛎相比，一般个体较小，壳型不规则，贝壳较硬；同一环境下养殖的潮间带牡蛎与潮下带牡蛎子一代在外形特征、抗性能力以及营养品质等表型上都表现出了一定的差异，但关于潮间带与潮下带牡蛎性状分化的内在机制缺乏认知，这种差异来自于遗传结构差异还是环境差异导致的可塑性并不清楚，潮间带与潮下带牡蛎的差异能否跨代遗传，能传递几代，其内在的机制是什么还有待探究。针对以上相关科学问题，本研究以潮间带和潮下带的长牡蛎（Crassostrea gigas）为研究对象，从环境、表型、群体遗传结构、基因表达、表观遗传修饰多个角度出发，聚焦DNA甲基化，开展了潮间带长牡蛎与潮下带长牡蛎当代以及跨代比较研究，以期解析长牡蛎在潮间带环境适应中的表观调控机制。具体内容及结果如下：

1. 潮间带环境对长牡蛎的直接影响

对取样地点河北乐亭海域的潮间带和潮下带海水温度进行检测，显示潮间带海域温度变异性更大，发生高温（大于30摄氏度）的天数更多。从野外采集得到野生潮间带和潮下带长牡蛎样品，进行表型、群体遗传结构和基因组甲基化层面的差异比较发现：两个群体存在适合度相关的表型分化，包括热激后死亡率、呼吸率和生理指标，其中潮间带牡蛎表现出更高的存活率和能量代谢水平；全基因组甲基化测序（WGBS）结果显示，潮间带和潮下带牡蛎群体存在基因组DNA甲基化分化，差异甲基化基因（DMGs）参与了脂类代谢、GTPase活性调控和细胞粘附等过程，但简化基因组技术未检测到群体遗传结构分化，说明潮间带潮下带牡蛎分化主要是由潮间带环境诱导，而非由遗传分化导致。

2. 环境诱导的表观修饰的遗传性

将野生潮间带和潮下带长牡蛎作为亲本，繁育得到F₁并于相同的潮下带环境中养殖，利用甲基化测序和转录组测序相结合的技术，探究潮间带环境诱导的DNA甲基化的遗传性。甲基化测序结果显示，子一代样品中也存在甲基化分化，且表观分化与遗传分化之间没有相关性，仍然支持表观分化主要由潮间带环境诱导而非依赖于遗传结构这一结果；亲本中有0.42的DMGs可以遗传到子一代，其中0.69的DMGs在两代牡蛎中具有一致的调控趋势。进一步在F₁中设置高温条件并进行全基因组甲基化测序，探究了F₁牡蛎基因组甲基化在高温条件下的响应，发现面对高温胁迫时，潮间带牡蛎基因组甲基化水平呈现下调的趋势，具有较高的可塑性，而潮下带牡蛎则相反；将甲基化数据与基因表达数据联合分析，分别在潮间带和潮下带牡蛎群体中鉴定得到了67个和55个基因表达量可能受DNA甲基化调控的基因，为后续甲基化功能验证提供了候选基因。

3. 环境诱导的表观修饰的遗传稳定性

将野生潮间带和潮下带长牡蛎作为亲本，连续两年繁育得到F₁和F₂，对这三代样品进行适合度相关的表型测定和DNA甲基化测序，并联合分析以探究环境诱导的DNA甲基化的遗传稳定性。首先从表型和DNA甲基化两个角度检测了潮间带环境的跨代影响。结果显示，在三代样品中，潮间带、潮下带牡蛎均在热激后死亡率、生理指标等表型上发生了分化；基因组DNA甲基化也存在分化，即潮间带环境诱导的表型和表观分化可以至少跨代遗传两代。其次检测了三代牡蛎对高温条件的甲基化响应，鉴定得到了320个可遗传的高温响应DMGs，这些基因可从能量代谢、信号转导和细胞凋亡等过程参与高温响应。

4. DNA甲基化对表型的调控机制

利用DNA甲基化转移酶抑制剂5-Aza降低长牡蛎基因组甲基化水平，并通过转录组测序和表型测定来解析DNA甲基化对基因表达和表型的影响。首先初步探索了抑制剂在牡蛎中的抑制效应，发现在一定浓度范围内，抑制效果与抑制剂剂量正相关；然后选择抑制效果最佳的一组牡蛎进行转录组测序，结果鉴定得到了246个差异表达基因（DEGs），这些基因显著富集到了超氧化物代谢过程和ATP合成过程中，对超氧化物歧化酶和ATPase进行活性测定，结果也验证了抑制组和对照组存在活性差异；进一步，在抑制剂处理的基础上，设置高温条件，发现抑制组牡蛎死亡速率更高，转录组测序鉴定得到了88个参与高温响应的DEGs，这些基因参与了碳水化合物和氨基酸代谢，信号转导，细胞凋亡和自噬以及机体免疫等多个过程。

第1章 引言... 1

1.1 海洋生物的环境适应... 1

1.1.1 潮间带环境与牡蛎... 1

1.1.2表型可塑性在适应中的作用... 3

1.2  表观遗传学研究进展... 4

1.2.1 表观遗传学与DNA甲基化的概念... 4

1.2.2 表观遗传学在环境适应中的作用... 9

1.3 DNA甲基化介导的跨代可塑性机制及研究进展... 14

1.3.1 DNA甲基化的发生与遗传... 15

1.3.2 跨代可塑性机制研究进展... 16

1.4 DNA甲基化对基因表达的调控... 17

1.4.1 DNA甲基化的调控特点... 17

1.4.2 DNA甲基化的抑制与应用... 18

1.5 本研究的目的与意义... 20

第2章 潮间带环境直接诱导牡蛎的表观修饰分化... 21

2.1 材料方法... 21

2.1.1 实验材料... 21

2.1.2 环境温度测定... 21

2.1.3 热耐受性测定... 21

2.1.4 呼吸率测定... 21

2.1.5 生理指标测定... 22

2.1.6 简化基因组测序... 23

2.1.7 全基因组甲基化测序（WGBS）... 24

2.1.8 统计学分析... 26

2.2 实验结果... 26

2.2.1 环境温度分析... 26

2.2.2 表型分化分析... 28

2.2.3 群体遗传结构分析... 28

2.2.4 DNA甲基化分化... 30

2.3 讨论... 32

2.4 小结... 33

第3章 潮间带环境诱导的表观变异的遗传性... 35

3.1 材料方法... 35

3.1.1 实验材料... 35

3.1.2 急性热激... 35

3.1.3 全基因组甲基化测序（WGBS）... 36

3.1.4 亚硫酸盐PCR测序（BSP）... 36

3.1.5 荧光定量PCR. 40

3.2 实验结果... 43

3.2.1 全基因组甲基化模式概况... 43

3.2.2 潮间带环境和急性热激诱导的F1代甲基化分化... 45

3.2.3 遗传效应评估... 51

3.2.4 甲基化与基因表达关联分析... 52

3.2.5 潮间带环境诱导的甲基化的一代遗传... 56

3.3 讨论... 60

3.4 小结... 63

第4章 潮间带环境诱导的表观分化的遗传稳定性... 65

4.1 材料方法... 65

4.1.1 实验材料... 65

4.1.2 急性热激与取样... 65

4.1.3 热耐受性测定... 66

4.1.4 生理指标测定... 66

4.1.5 全基因组甲基化测序（WGBS）... 66

4.2 实验结果... 66

4.2.1 表型分析... 66

4.2.2 潮间带环境诱导的表观分化的遗传稳定性... 67

4.2.3 潮间带牡蛎热响应基因的跨代遗传... 69

4.3 讨论... 74

4.4 小结... 78

第5章 DNA甲基化对表型的调控机制研究... 79

5.1 材料方法... 79

5.1.1 实验材料... 79

5.1.2 抑制剂处理... 79

5.1.3 死亡率监测... 80

5.1.4 甲基化水平测定... 80

5.1.5 生理指标测定... 83

5.1.6 转录组测序... 83

5.2 实验结果... 84

5.2.1 室温条件DNA甲基化调控情况... 84

5.2.2 高温条件DNA甲基化调控情况... 88

5.3 讨论... 95

5.3.1 室温条件DNA甲基化调控情况... 95

5.3.2 高温条件DNA甲基化调控情况... 97

5.4 小结... 99

第6章 全文总结... 101

附录 缩略词表... 103

参考文献... 105

致 谢... 119

作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果... 121