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牙鲆生物钟基因Baml1和Cry1的表达调控以及对免疫功能的影响 | |
张鹏 | |
学位类型 | 博士 |
导师 | 孙黎 |
2021-05 | |
学位授予单位 | 中国科学院海洋研究所 |
学位授予地点 | 中国科学院海洋研究所 |
学位名称 | 理学博士 |
关键词 | 牙鲆 生物钟 免疫系统 脑和肌肉组织芳香烃受体核转运蛋白的类似蛋白1 隐花色素 |
摘要 | 生物钟系统在自然界的有机生命体内广泛存在。生物钟系统能响应外界环境光的变化来调控生物体的各种生理活动,包括免疫反应。在高等动物的生物钟系统中,转录激活蛋白——脑和肌肉组织芳香烃受体核转运蛋白的类似蛋白1(brain and muscle aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator protein-like-1,BMAL1)通过结合特定的启动子序列促进隐花色素(cryptochrome,Cry)等目的基因的转录表达。大量研究表明Bmal1和Cry1在机体的免疫调控过程中发挥着重要的功能。本论文研究了牙鲆(Paralichthys olivaceus)Bmal1(PoBmal)和Cry1(PoCry1)在生物钟节律表达以及免疫应答调控中的功能。 首先,我们研究了光暗刺激是否能影响牙鲆抗细菌的感染能力。我们用迟缓爱德华氏菌Edwardsiella tarda(E. tarda)感染LL(持续的光照)、DD(持续的黑暗)、LD(先光照后黑暗)、DL(先黑暗后光照)四种不同条件下养殖的牙鲆,发现在感染36 h DD组和DL组鱼的头肾和脾脏中的细菌数量明显高于LL组和LD组。通过qRT-PCR技术检测了不同组织中四个促炎症细胞因子(IL-1β、IL-6、IL-8和 TNF-α)在24小时光暗交替周期内七个不同时间点的表达情况,这七个时间点具体为:7:00 授时0时即ZT 0,11:00 授时ZT 4,15:00 授时ZT 8,19:00 授时ZT 12,23:00 授时ZT 16,3:00 授时ZT 20,第二天7:00 授时ZT 24。结果发现四个促炎症细胞因子的表达趋势整体上是类似的,都随着光刺激的延长表达量逐渐升高,在光刺激的末期(ZT 12)到达峰值,之后随着进入黑暗阶段,其表达又逐步下调。随后在牙鲆的脑、肝脏、脾脏和头肾组织中通过qRT-PCR技术检测了24小时光暗交替周期内七个不同时间点PoBmal1和PoCry1的节律表达。结果发现,PoBmal1的表达与促炎症细胞因子的表达趋势类似,都是在光照阶段稳步上升,在光照刺激的末期达到顶峰,然后在黑暗环境中稳步下降,最后达到最低水平。而PoCry1的表达相反。通过序列比对发现PoBmal1和PoCry1与其它物种的Bmal1和Cry1氨基酸序列相似性很高。其次,通过qRT-PCR技术发现PoBmal1和PoCry1在牙鲆组织中呈广谱性分布。之后通过细菌感染牙鲆实验发现,细菌感染能抑制PoBmal1和PoCry1的mRNA表达。这些结果表明细菌感染能影响牙鲆的生物钟系统表达。 为了进一步研究PoBmal1和PoCry1的功能,在牙鲆体内进行了这两个基因的敲降实验。PoBmal1敲降后,PoCry1、PoCry2和四个促炎症细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的表达都显著下降。这表明在牙鲆正常生长状态下,PoCry基因以及四个促炎症细胞因子是受PoBmal1正调控的。随后对PoBmal1基因敲降的牙鲆进行了细菌感染实验,发现在头肾和肝脏组织中,PoBmal1敲降组感染细菌的数量与对照组和空白实验组相比都显著下降,表明敲降PoBmal1基因的表达可能有利于牙鲆抵抗细菌的侵染。为了进一步揭示PoBmal1敲降对牙鲆感染细菌的影响,我们使用了qRT-PCR技术检测了上述刺激的牙鲆不同组织中促炎症细胞因子的表达情况,发现促炎症细胞因子在不同组织中呈现出不同程度的上调。这表明细菌侵染牙鲆后,敲降PoBmal1基因,可能会通过某些途径促进促炎症细胞因子的转录激活。另外,我们对牙鲆也进行了PoCry1基因的体内敲降实验,发现PoCry1敲降后免疫效应分子IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12 p35、IL-12 p40a、TNF-α、CXCL10、CCL19和NOS1都出现了不同程度的上调,这表明它们是受PoCry1负调控的。随后,对PoCry1基因敲降的牙鲆进行了细菌感染实验,结果表明在细菌感染后敲降组感染细菌的数量与对照组和空白实验组相比显著下降。同时通过qRT-PCR技术检测了上述刺激的牙鲆在脾脏中免疫相关效应分子的表达情况,发现免疫相关效应分子均出现了不同程度的上调。为了进一步探究PoCry1在免疫调控机制方面的功能,在用细菌侵染PoCry1基因敲降的牙鲆时,再同时给牙鲆注射PKA抑制剂H89 2HCl,结果发现敲降PoCry1并注射抑制剂的牙鲆组织感染细菌的数量与仅敲降PoCry1组相比上升很多,而免疫相关效应分子的表达与仅敲降PoCry1实验组相比却下调很多。这表明细菌侵染PoCry1敲降的牙鲆可能会导致牙鲆体内PKA的活性增强,并可能促进了下游NF-κ B信号通路的激活,进而促进了一些免疫效应分子的表达,提高了牙鲆的抗感染能力。 通过上述对牙鲆PoBmal1和PoCry1功能研究,我们发现光是能够影响牙鲆的抗感染能力,也能影响牙鲆两个生物钟基因PoBmal1和PoCry1的表达,通过深入研究我们发现这两个生物钟基因PoBmal1和PoCry1在调控牙鲆免疫应答过程中发挥着重要的功能。 |
学科门类 | 理学 ; 理学::生物学 |
语种 | 中文 |
文献类型 | 学位论文 |
条目标识符 | http://ir.qdio.ac.cn/handle/337002/170658 |
专题 | 中国科学院海洋研究所 |
推荐引用方式 GB/T 7714 | 张鹏. 牙鲆生物钟基因Baml1和Cry1的表达调控以及对免疫功能的影响[D]. 中国科学院海洋研究所. 中国科学院海洋研究所,2021. |
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