IOCAS-IR  > 实验海洋生物学重点实验室
牙鲆基因编辑技术构建及其应用的初步研究
王凌
Subtype博士
Thesis Advisor尤锋
2021-05-23
Degree Grantor中国科学院大学
Place of Conferral中国科学院海洋研究所
Degree Name理学博士
Keyword牙鲆,显微注射及电转,CRISPR/Cas9系统,PGC迁移因子,dnali1
Abstract

近年来,锌指核酸酶(Zinc-finger nucleasesZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nucleasesTALEN)及CRISPR-Cas9Clustered regularly inter spaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins)等基因编辑技术发展迅速,借助于基因敲除技术在DNA水平上对基因进行遗传操作,进而通过生物表型及相关基因的差异表达对基因功能进行研究成为现实。其中,CRISPR/Cas9系统由于其在实验操作过程中的灵活性、简便性,能够高通量操作及效率高等明显优势已经广泛应用于相关研究中,成为当代生物学的研究热点。但是,目前在鱼类中CRISPR/Cas9基因编辑的研究还主要集中在模式鱼种及淡水鱼类中,海水鱼类中的研究较少。牙鲆Paralichthys olivaceus是中国、韩国和日本等国非常重要的海水养殖鱼种,其生长及性别性状等均是其养殖和育种的主要目标。因此,在牙鲆中建立系统完善的CRISPR/Cas9基因编辑技术,将有助于对其基因功能及经济性状的分子机制解析,从而指导其遗传育种。本研究主要开展了基于显微注射方法和电转法的外源物质导入牙鲆受精卵技术的构建,初步建立了牙鲆CRISPR/Cas9基因编辑操作平台;对影响原始生殖细胞(Primordial germ cellsPGCs)迁移的atypical chemokine receptor 3bcxcr7b)和staufen double-stranded RNA binding protein 2stau2)基因进行了克隆、表达分析及基因编辑实验;通过原位杂交等实验初步分析了上述两个基因与stromal cell-derived factor 1 sdf1)和chemokineC-X-C motif receptor 4bcxcr4b)等基因对牙鲆PGC迁移的影响;同时,还对精巢中高表达的dynein axonemal light intermediate chain1dnali1)基因进行克隆和调控分析。研究结果将为海水鱼类基因编辑平台构建及应用提供基础,也将为其基因功能研究提供平台。具体研究结果如下:

首先,建立了基于显微注射和电转法将外源物质导入牙鲆受精卵的方法。在受精卵发育至一到四细胞期,通过显微注射将罗丹明与质粒导入受精卵中,效率检测结果表明外源物质可以有效地进入到受精卵中并能够表达活性。同时,利用NEPA21电转仪测试了导入外源物质的方法,共设置3种条件,经成活率检测获得牙鲆电转的最适条件是在25V电压下3次脉冲每次持续1 ms,间隔为50 ms。以此为基础,对gonadal somatic cell derived factorgsdfmyomaker基因进行基因敲除。在显微注射和电转法中均检测到了2个基因的插入和缺失突变,且显微注射法的突变率要高于电转法。为了提高突变效率,对显微注射的浓度进行了筛选,分析表明低浓度(Cas9 mRNA 250 ng/μLgRNA 100 ng/μL)、单个gRNA位点突变率普遍偏低(14.3-45 %),而高浓度组(Cas9 mRNA 1500 ng/μLgRNA 1000 ng/μL)、2gRNA位点条件下基因的突变率最高能达到60-80 %。实验结果显示高浓度的注射条件更适合牙鲆的基因编辑。

同时,克隆了影响PGC迁移的因子cxcr7bstau2。并与sdf1cxcr4b两个PGC迁移因子一起进行表达分析,结果显示sdf1stau2基因从一细胞期开始表达,而cxcr4bcxcr7b从囊胚期开始表达。在成鱼中,sdf1cxcr4bcxcr7bstau2在多个组织中均有表达,其中sdf1基因在精巢中的表达高于卵巢,cxcr4bcxcr7bstau2基因在卵巢中的表达量要高于精巢。通过上面建立的显微注射CRISPR方法,对牙鲆sdf1cxcr4bcxcr7bstau2基因进行基因编辑实验,均获得有效突变的初孵仔鱼个体,sdf1cxcr4b突变率较低,约为20-30 %,而cxcr7bstau2突变率较高,可达到70-80 %

进一步从实验室已有的牙鲆精卵巢转录组数据中筛选出一个在精巢中高表达的dynein axonemal light intermediate chain 1dnali1)基因,经克隆发现,其编码区包含771 bp,编码256氨基酸,在5'UTR中存在不同大小的2个剪接体,且大的仅在精巢中表达。转录因子结合位点比较显示较小的5'UTR中缺失1SOX51SOX10结合位点。该基因主要在成体组织的精巢中表达,卵巢中几乎没有表达。在牙鲆基因组及基因克隆片段中检测到两个922 bp重复片段,借助斑马鱼的转基因,通过瞬时表达分析发现它们具有不同的调控活性,显示重复编码区可能具有双重功能,可以控制特异性翻译并保持RNA稳定性。这是海水鱼类中的关于dnali1基因的首次报道,两个剪接体也属首次发现,将为分析牙鲆精子形成过程以及各组织器官的纤毛发育的分子机制解析提供依据。

MOST Discipline Catalogue理学 ; 理学::海洋科学
Language中文
Table of Contents

.... I

第一章 绪论.... 1

1.1 基因编辑技术... 1

1.1.1 ZFN技术... 3

1.1.2 TALEN技术... 4

1.1.3 CRISPR/Cas9技术... 4

1.2 鱼类中的基因编辑... 8

1.2.1 常用基因编辑技术... 8

1.2.2 鱼类外源基因导入方法... 10

1.3 基因调控元件的相关研究... 12

1.3.1 UTR在基因功能中的作用... 13

1.3.2 基因重复片段... 15

1.4 鱼类PGC迁移和性腺发育基因编辑相关研究... 15

1.4.1 原始生殖细胞迁移... 16

1.4.2 鱼类的性腺发育研究... 18

1.4.3 鱼类配子的发生... 19

1.5 研究目的及意义... 21

第二章 牙鲆基因编辑技术的初步构建.... 23

第一节 外源物质导入方法的建立... 23

2.1.1 研究背景... 23

2.1.2 材料与方法... 24

2.1.3 结果... 26

2.1.4 讨论... 30

2.1.5 小结... 32

第二节 牙鲆基因编辑技术的初步构建... 33

2.2.1 研究背景... 33

2.2.2 材料与方法... 34

2.2.3 结果... 39

2.2.4 讨论... 44

2.2.5 小结... 46

第三节 牙鲆CRISPR/Cas9基因编辑参数的优化... 47

2.3.1 研究背景... 47

2.3.2 材料与方法... 47

2.3.3 结果... 50

2.3.4 讨论... 59

2.3.5 小结... 60

第三章 牙鲆PGCs迁移相关基因基因编辑的初步研究.... 61

3.1 研究背景... 61

3.2 材料和方法... 62

3.2.1 实验材料... 62

3.2.2 主要试剂与仪器... 62

3.2.3 实验方法... 63

3.3 结果... 72

3.3.1 牙鲆cxcr7bstau2基因序列分析... 72

3.3.2 组织差异表达... 78

3.3.3 牙鲆cxcr7bstau2基因在胚胎发育期的差异表达... 79

3.3.4 牙鲆cxcr7bstau2sdf1cxcr4b基因编辑结果分析... 80

3.4 讨论... 85

3.4.1 Cxcr7bstau2组织表达的差异以及与PGCs的定位迁移的相关性... 85

3.4.2 牙鲆cxcr7bstau2sdf1cxcr4b的基因编辑... 86

3.5小结... 87

第四章 牙鲆dnali1基因调控的初步研究.... 89

4.1研究背景... 89

4.2 材料和方法... 90

4.2.1 实验材料... 90

4.2.2 主要试剂与仪器... 91

4.2.3 实验方法... 91

4.3结果... 96

4.3.1牙鲆dnali1基因序列... 96

4.3.2牙鲆dnali1基因组序列... 100

4.3.3 Dnali1基因在牙鲆成体组织的表达... 101

4.3.4牙鲆dnali1基因在性腺I-V期的差异表达... 101

4.3.5 5'UTR可变剪接的雌雄差异表达... 103

4.3.6 3'UTR调控分析... 105

4.4 讨论... 107

4.4.1 5'UTR剪接体差异... 107

4.4.2 基因中重复片段的功能进化... 108

4.4.3 Dnali1功能多样性... 109

4.5小结... 111

结论... 113

参考文献... 115

致谢... 135

作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果... 137

Document Type学位论文
Identifierhttp://ir.qdio.ac.cn/handle/337002/170657
Collection实验海洋生物学重点实验室
Recommended Citation
GB/T 7714
王凌. 牙鲆基因编辑技术构建及其应用的初步研究[D]. 中国科学院海洋研究所. 中国科学院大学,2021.
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