Institutional Repository of Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences
牙鲆基因编辑技术构建及其应用的初步研究 | |
王凌 | |
学位类型 | 博士 |
导师 | 尤锋 |
2021-05-23 | |
学位授予单位 | 中国科学院大学 |
学位授予地点 | 中国科学院海洋研究所 |
学位名称 | 理学博士 |
关键词 | 牙鲆,显微注射及电转,CRISPR/Cas9系统,PGC迁移因子,dnali1 |
摘要 | 近年来,锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases,ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases,TALEN)及CRISPR-Cas9(Clustered regularly inter spaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins)等基因编辑技术发展迅速,借助于基因敲除技术在DNA水平上对基因进行遗传操作,进而通过生物表型及相关基因的差异表达对基因功能进行研究成为现实。其中,CRISPR/Cas9系统由于其在实验操作过程中的灵活性、简便性,能够高通量操作及效率高等明显优势已经广泛应用于相关研究中,成为当代生物学的研究热点。但是,目前在鱼类中CRISPR/Cas9基因编辑的研究还主要集中在模式鱼种及淡水鱼类中,海水鱼类中的研究较少。牙鲆Paralichthys olivaceus是中国、韩国和日本等国非常重要的海水养殖鱼种,其生长及性别性状等均是其养殖和育种的主要目标。因此,在牙鲆中建立系统完善的CRISPR/Cas9基因编辑技术,将有助于对其基因功能及经济性状的分子机制解析,从而指导其遗传育种。本研究主要开展了基于显微注射方法和电转法的外源物质导入牙鲆受精卵技术的构建,初步建立了牙鲆CRISPR/Cas9基因编辑操作平台;对影响原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGCs)迁移的atypical chemokine receptor 3b(cxcr7b)和staufen double-stranded RNA binding protein 2(stau2)基因进行了克隆、表达分析及基因编辑实验;通过原位杂交等实验初步分析了上述两个基因与stromal cell-derived factor 1 (sdf1)和chemokine(C-X-C motif) receptor 4b(cxcr4b)等基因对牙鲆PGC迁移的影响;同时,还对精巢中高表达的dynein axonemal light intermediate chain1(dnali1)基因进行克隆和调控分析。研究结果将为海水鱼类基因编辑平台构建及应用提供基础,也将为其基因功能研究提供平台。具体研究结果如下: 首先,建立了基于显微注射和电转法将外源物质导入牙鲆受精卵的方法。在受精卵发育至一到四细胞期,通过显微注射将罗丹明与质粒导入受精卵中,效率检测结果表明外源物质可以有效地进入到受精卵中并能够表达活性。同时,利用NEPA21电转仪测试了导入外源物质的方法,共设置3种条件,经成活率检测获得牙鲆电转的最适条件是在25V电压下3次脉冲每次持续1 ms,间隔为50 ms。以此为基础,对gonadal somatic cell derived factor(gsdf)和myomaker基因进行基因敲除。在显微注射和电转法中均检测到了2个基因的插入和缺失突变,且显微注射法的突变率要高于电转法。为了提高突变效率,对显微注射的浓度进行了筛选,分析表明低浓度(Cas9 mRNA 250 ng/μL和gRNA 100 ng/μL)、单个gRNA位点突变率普遍偏低(14.3-45 %),而高浓度组(Cas9 mRNA 1500 ng/μL和gRNA 1000 ng/μL)、2个gRNA位点条件下基因的突变率最高能达到60-80 %。实验结果显示高浓度的注射条件更适合牙鲆的基因编辑。 同时,克隆了影响PGC迁移的因子cxcr7b和stau2。并与sdf1和cxcr4b两个PGC迁移因子一起进行表达分析,结果显示sdf1与stau2基因从一细胞期开始表达,而cxcr4b和cxcr7b从囊胚期开始表达。在成鱼中,sdf1、cxcr4b、cxcr7b和stau2在多个组织中均有表达,其中sdf1基因在精巢中的表达高于卵巢,cxcr4b、cxcr7b和stau2基因在卵巢中的表达量要高于精巢。通过上面建立的显微注射CRISPR方法,对牙鲆sdf1、cxcr4b、cxcr7b和stau2基因进行基因编辑实验,均获得有效突变的初孵仔鱼个体,sdf1和cxcr4b突变率较低,约为20-30 %,而cxcr7b和stau2突变率较高,可达到70-80 %。 进一步从实验室已有的牙鲆精卵巢转录组数据中筛选出一个在精巢中高表达的dynein axonemal light intermediate chain 1(dnali1)基因,经克隆发现,其编码区包含771 bp,编码256氨基酸,在5'UTR中存在不同大小的2个剪接体,且大的仅在精巢中表达。转录因子结合位点比较显示较小的5'UTR中缺失1个SOX5和1个SOX10结合位点。该基因主要在成体组织的精巢中表达,卵巢中几乎没有表达。在牙鲆基因组及基因克隆片段中检测到两个922 bp重复片段,借助斑马鱼的转基因,通过瞬时表达分析发现它们具有不同的调控活性,显示重复编码区可能具有双重功能,可以控制特异性翻译并保持RNA稳定性。这是海水鱼类中的关于dnali1基因的首次报道,两个剪接体也属首次发现,将为分析牙鲆精子形成过程以及各组织器官的纤毛发育的分子机制解析提供依据。 |
学科门类 | 理学 ; 理学::海洋科学 |
语种 | 中文 |
目录 |
1.4 鱼类PGC迁移和性腺发育基因编辑相关研究... 15 第三节 牙鲆CRISPR/Cas9基因编辑参数的优化... 47 第三章 牙鲆PGCs迁移相关基因基因编辑的初步研究.... 61 3.3.1 牙鲆cxcr7b和stau2基因序列分析... 72 3.3.3 牙鲆cxcr7b和stau2基因在胚胎发育期的差异表达... 79 3.3.4 牙鲆cxcr7b、stau2、sdf1和cxcr4b基因编辑结果分析... 80 3.4.1 Cxcr7b和stau2组织表达的差异以及与PGCs的定位迁移的相关性... 85 3.4.2 牙鲆cxcr7b、stau2、sdf1和cxcr4b的基因编辑... 86 4.3.3 Dnali1基因在牙鲆成体组织的表达... 101 |
文献类型 | 学位论文 |
条目标识符 | http://ir.qdio.ac.cn/handle/337002/170657 |
专题 | 实验海洋生物学重点实验室 |
推荐引用方式 GB/T 7714 | 王凌. 牙鲆基因编辑技术构建及其应用的初步研究[D]. 中国科学院海洋研究所. 中国科学院大学,2021. |
条目包含的文件 | ||||||
文件名称/大小 | 文献类型 | 版本类型 | 开放类型 | 使用许可 | ||
王凌 毕业论文最终版.pdf(7605KB) | 学位论文 | 延迟开放 | CC BY-NC-SA | 浏览 2025-7-1后可获取 |
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