实验海洋生物学重点实验室知识库

半乳糖凝集素（galectin）是一种对β-半乳糖苷（β-galactosides）具有高亲和力的凝集素。在哺乳动物中已发现半乳糖凝集素具有多种生物学功能。在鱼类中发现半乳糖凝集素是重要的模式识别受体，能够识别多种病原体。然而对鱼类半乳糖凝集素的其他免疫功能的研究还不多。我们从半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）基因组中鉴定了galectin-8（CsGal-8），对其免疫功能进行了研究。

CsGal-8的开放阅读框含有939 bp核苷酸，编码312个氨基酸。CsGal-8属于串联重复型半乳糖凝集素，含有两个糖识别结构域（carbohydrate recognition domains，CRDs），由48个氨基酸残基的多肽链相连接。CsGal-8与其他鱼类galectin-8序列相似性在~70%-80%之间。CsGal-8在多种组织中表达分布，在肾和脾等免疫相关器官中表达水平很高。迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）刺激后，CsGal-8在半滑舌鳎肾、脾和血液中表达水平显著上调。亚细胞定位分析发现CsGal-8主要分布在细胞质中，并能够以囊泡的形式被分泌到细胞外。CsGal-8的重组蛋白（rCsGal-8）对乳糖、半乳糖、果糖和海藻糖具有非常高的亲和性，并且rCsGal-8与糖的亲和性与rCsGal-8的剂量呈正相关。rCsGal-8能够广泛的结合革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，尤其是对鳗弧菌（Vibrio anguillarum）和哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）有很强的结合能力。用鳗弧菌侵染过表达CsGal-8的RAW264.7细胞发现CsGal-8能够与侵入细胞内的鳗弧菌共定位。rCsGal-8与细菌的结合能够被糖所抑制。rCsGal-8能够对三种革兰氏阴性菌（鳗弧菌、哈维氏弧菌和大肠杆菌Escherichia coli）造成直接的杀伤作用。rCsGal-8能够对鳗弧菌的细胞膜造成严重破坏，并使细菌的形态发生改变。此外，rCsGal-8能够抑制外周血白细胞产生活性氧（ROS）。

本论文的研究结果表明CsGal-8在半滑舌鳎的免疫识别、抗细菌感染以及免疫调控过程中发挥重要作用。在鱼类中首次发现半乳糖凝集素具有直接的杀菌作用。研究结果为利用凝集素防控鱼类病害提供了新的思路。

第 1 章 绪论..............................................................................................................1

1.1 半乳糖凝集素.....................................................................................................1

1.1.1 半乳糖凝集素定义与分类..........................................................................1

1.1.2 半乳糖凝集素的结构..................................................................................2

1.1.3 半乳糖凝集素与糖的结合机制..................................................................3

1.1.4 半乳糖凝集素的组织分布..........................................................................4

1.1.5 半乳糖凝集素的分泌..................................................................................4

1.1.6 半乳糖凝集素的功能..................................................................................5

1.2 半滑舌鳎简介.....................................................................................................8

1.3 半乳糖凝集素在鱼类中的研究现状.................................................................8

1.4 研究目的及意义.................................................................................................9

第 2 章 半滑舌鳎半乳糖凝集素-8 的序列分析..........................................11

2.1 实验材料与方法...............................................................................................11

2.2 实验结果...........................................................................................................12

2.2.1 半滑舌鳎半乳糖凝集素-8 序列分析 .......................................................12

2.2.2 序列比对....................................................................................................13

2.2.3 三维结构预测............................................................................................14

2.3 讨论...................................................................................................................15

第 3 章 半滑舌鳎半乳糖凝集素-8 的组织表达与亚细胞定位..............17

3.1 实验材料与方法...............................................................................................17

3.1.1 实验动物....................................................................................................17

3.1.2 实验细胞....................................................................................................17

3.1.3 实验菌株....................................................................................................17

3.1.4 实时荧光定量 PCR...................................................................................18

3.1.5 真核细胞过表达载体构建........................................................................22

3.1.6 CsGal-8 在细胞中的定位分析 .................................................................27

3.2 实验结果...........................................................................................................29

3.2.1 CsGal-8 的组织表达分布 ..........................................................................29

3.2.2 CsGal-8 的亚细胞定位 ..............................................................................31

3.3 讨论...................................................................................................................32

第 4 章 半滑舌鳎半乳糖凝集素-8 的免疫功能研究.................................35

4.1 实验材料与方法...............................................................................................35

4.1.1 实验细胞....................................................................................................35

4.1.2 实验菌株....................................................................................................35

4.1.3 重组蛋白的表达与纯化............................................................................35

4.1.4 酶联免疫吸附试验....................................................................................37

4.1.5 CsGal-8 与侵入细胞内细菌的共定位分析 ..............................................39

4.1.6 流式细胞术检测细胞对细菌的吞噬........................................................39

4.1.7 重组蛋白对细菌的杀伤能力检测............................................................40

4.1.8 碘化丙啶染色分析....................................................................................41

4.1.9 电子显微镜分析........................................................................................41

4.1.10 ROS 测定..................................................................................................41

4.2 实验结果...........................................................................................................42

4.2.1 rCsGal-8 的 SDS-PAGE 分析....................................................................42

4.2.2 rCsGal-8 与糖的结合.................................................................................43

4.2.3 rCsGal-8 与细菌的结合.............................................................................44

4.2.4 CsGal-8 与鳗弧菌在细胞中共定位 ..........................................................46

4.2.5 rCsGal-8 对细菌的杀伤作用.....................................................................47

4.2.6 rCsGal-8 对革兰氏阳性菌调理作用的检测.............................................51

4.2.7 rCsGal-8 对外周血白细胞产生活性氧的影响.........................................52

4.3 讨论：...............................................................................................................54

结论............................................................................................................................59

参考文献...................................................................................................................61

附录 本研究所用溶液配制方法.......................................................................71

致谢............................................................................................................................75

作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果..........................77