IOCAS-IR  > 实验海洋生物学重点实验室
壳聚糖烟酰胺席夫碱铜配合物抑菌机制研究
马玉珍
Subtype博士
Thesis Advisor李鹏程
2020-05-15
Degree Grantor中国科学院海洋研究所
Place of Conferral中国科学院海洋研究所
Degree Name理学博士
Degree Discipline海洋生物学
KeywordO-csln-cu 辣椒疫霉菌 代谢组学-蛋白质组学联合分析 抑卵菌机制
Abstract

随着铜在农药中的广泛应用,铜杀菌剂经历了无机铜、合成有机铜和天然有机铜三个发展阶段。随着人们对食品安全和环境友好的要求不断提高,高效低毒的天然基质铜是未来农药的发展趋势。目前铜制剂的抗菌机制研究主要集中在细菌,而抗真菌尤其是卵菌机制尚不清楚。本实验室以甲壳素/壳聚糖(CS)为基质合成了一种天然有机铜制剂壳聚糖烟酰胺席夫碱铜配合物(O-CSLn-Cu),并以辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici Leonian)为研究对象,采用串联质谱(TMT蛋白质组学和液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)非靶向代谢组学相结合的方法,从蛋白质组的调控通路分析,到代谢组的调控通路验证,最终以联合分析与表型验证相结合的方式,逐步推理出O-CSLn-CuP. capsici Leonian的抑真菌机制。该研究不仅为大分子杀菌剂的抑菌机制研究提供新思路,也为该有机铜制剂的产业应用奠定了理论基础。

本文深入研究了O-CSLn-CuP. capsici Leonian的抑真菌机制,获得主要结果如下:

  1. 首先合成O-CSLn-Cu并表征,然后测定O-CSLn-CuP. capsici Leonian 活性,最后利用蛋白组学筛选O-CSLn-Cu作用前后菌体蛋白水平的差异通路,探讨O-CSLn-Cu作用方式。红外光谱结果显示O-CSLn-Cu金属配合物合成成功;抑菌实验测定的O-CSLn-Cu抑制P. capsici Leonian的药物半抑制浓度为0.15 mg/mL,最佳处理时间为12 hTMT定量蛋白质组学分析结果中共鉴定到5021个蛋白质,其中包括1172个差异蛋白质。KEGG通路富集结果显示氨基酸代谢,丙酸代谢,丙酮酸代谢,乙醛酸和二羧酸代谢,甘油脂代谢以及谷胱甘肽代谢途径变化显著。GO 功能富集的结果表明,在生物学过程和分子功能中,Acetyl-CoA相关代谢变化显著;在细胞组分中,质膜与内膜等定位蛋白同样发生了显著性变化。
  2. 利用代谢组学进一步测定O-CSLn-Cu作用前后菌体的差异代谢物。利用超高效液相串联四极杆飞行时间二级质谱技术鉴定到93个差异代谢物。KEGG通路富集结果显示乙醛酸和二元酸代谢、TCA循环、蛋白质消化和吸收、氨基酸代谢以及嘌呤代谢代谢途径变化显著,且与蛋白质组的差异代谢通路密切相关。代谢物分类结果显示:40%的差异代谢物属于有机酸及其衍生物,而其中大部分都是氨基酸、肽及其类似物。代谢产物亚细胞定位结果表明:大部分差异代谢物分布在细胞质、线粒体、细胞膜及细胞器膜上。其中线粒体包含了柠檬酸在内的32种差异代谢物,是含差异代谢产物最多的细胞器。
  3. 运用蛋白质组学与代谢组学联合分析,筛选O-CSLn-CuP. capsici Leonian作用后的主要差异代谢通路。联合分析结果显示,与能量相关的代谢途径变化显著,透射电子显微镜(TEM)观察到线粒体内膜消失。进一步利用生化实验验证组学的分析结果,酶活性测定结果表明糖酵解限速酶磷酸果糖激酶活性升高,TCA循环中的α酮戊二酸脱氢酶活性下降,代谢物检测发现柠檬酸水平显著下降,说明O-CSLn-Cu可引起线粒体损伤,诱导P. capsici Leonian 产生华宝效应“Warburg effect”,即线粒体呼吸链功能不全,细胞质中糖酵解速率增加。同时代谢物检测发现ATP水平显著下降,说明胞内能量供应不足,外源添加ATP可降低O-CSLn-Cu的抑菌率,但不能达到100%缓解率。此外,二氯荧光素实验显示菌体内活性氧(ROS)大量积累,推测线粒体损伤与ROS积累可能形成恶性循环,导致菌体死亡。因此线粒体可能是O-CSLn-Cu抗真菌作用的重要靶点。
  4. 为进一步探究O-CSLn-Cu上游的抑菌过程,首先设计合成了荧光素标记的壳聚糖席夫碱铜配合物(FITC-O-CSLn-Cu)并表征,然后对FITC-O-CSLn-Cu进行细胞定位,最后结合组学分析和生化实验探究菌体功能受损情况。红外光谱结果显示FITC-O-CSLn-Cu金属配合物合成成功;利用激光扫描共聚焦显微镜观察到FITC-O-CSLn-Cu可进入胞内,TEM结果显示O-CSLn-Cu破坏了细胞膜结构,使细胞膜出现非正常的间隙泡结构;差异蛋白质和代谢物亚细胞定位发现,大部分显著性差异的候选物呈下调趋势,稳定细胞渗透压的关键蛋白—水离子通道蛋白10PcAqp10)显著下调倍数最大。细胞膜荧光强度检测结果表明O-CSLn-Cu破坏细胞膜蛋白质成分;体内丙二醛含量检测及体外囊泡实验说明O-CSLn-Cu破坏脂质成分。细胞渗透检测结果显示,O-CSLn-Cu引起菌体电导率增大,蛋白质和糖类外泄增加;TMA-DPH实验表明O-CSLn-Cu导致细胞膜流动性下降;实时荧光定量PCR实验显示O-CSLn-Cu处理组的 PcAqp10mRNA显著下调。以上结果说明O-CSLn-Cu可损伤细胞膜结构,影响P. capsici Leonian细胞膜众多生理功能。PcAqp10可能是O-CSLn-Cu抑菌过程中,膜上的重要分子靶标。

综上,本研究利用蛋白质组学和代谢组学探究了P. capsici LeonianO-CSLn-Cu作用下的分子反应。结合多角度的抑菌靶标分析及验证,发现O-CSLn-Cu能够破坏菌丝形态,损伤细胞膜结构和功能,降低细胞膜选择透过性和流动性;同时进入胞内引起线粒体损伤,降低线粒体能量代谢效率,进而影响ATP水平,最终导致P. capsici Leonian死亡。因此O-CSLn-Cu是一个多靶标,高效率的抗真菌剂。

Subject Area理学
MOST Discipline Catalogue生物学
Pages142
Language中文
Document Type学位论文
Identifierhttp://ir.qdio.ac.cn/handle/337002/164675
Collection实验海洋生物学重点实验室
中国科学院海洋研究所
Recommended Citation
GB/T 7714
马玉珍. 壳聚糖烟酰胺席夫碱铜配合物抑菌机制研究[D]. 中国科学院海洋研究所. 中国科学院海洋研究所,2020.
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