IOCAS-IR  > 实验海洋生物学重点实验室
大型绿藻浒苔CRISPR/Cas9基因编辑技术的建立
其他题名Development of CRISPR/Cas9 genome editing techniques in green seaweed Ulva prolifera
郭扬
第一作者单位中国科学院海洋研究所
学位类型博士
导师姜鹏
2018-05
学位授予单位中国科学院大学
学位授予地点中国科学院海洋研究所
学位名称理学博士
学位专业海洋生物学
关键词类胡萝卜素合成相关基因 Crispr/cas9 基因编辑 硝酸还原酶基因 浒苔
摘要

        CRISPR/Cas9是新一代基因编辑技术,在生物学基础研究与遗传育种领域正迅速得到应用。大型海藻是我国重要的海水养殖对象,具有突出的研究价值和经济价值,但基因编辑技术尚未建立。浒苔(Ulva prolifera)属于大型绿藻,其生活史周期短便于调控、具有多种繁殖再生方式、能够在封闭水体中高效增殖,特别是浒苔的细胞核与叶绿体遗传转化技术均已系统建立,因此,浒苔是开展大型海藻基因编辑技术的理想实验材料。

    本文以浒苔为材料,围绕靶基因的克隆、靶基因的基因编辑、以及后续基因编辑技术验证平台的建立三个方面,系统建立了浒苔CRISPR/Cas9基因编辑技术,取得以下研究进展:

    首先,在浒苔中克隆得到硝酸还原酶基因并完成功能验证。根据缘管浒苔转录组数据,通过RACERapid amplification of cDNA ends)和染色体步移克隆了UpNR基因。发现UpNR基因包括六个内含子和七个外显子,编码863个氨基酸,包括NR的全部五个重要功能域和21个重要活性残基。通过qPCR验证了UpNR基因功能,阐明了多种氮源条件下UpNR的表达特征。UpNR基因的克隆与功能验证为建立浒苔CRISPR/Cas9基因编辑技术提供了一个理想的靶基因位点。

    其次,在浒苔中成功实现UpNR基因的CRISPR/Cas9基因编辑。我们针对UpNR基因设计了系列sgRNA,通过体外介导靶基因编辑验证了的活性;优选高活性sgRNA构建了系列基因敲除载体,利用浒苔遗传转化体系完成了载体导入,成功检测到cas9基因和sgRNA在浒苔体内的转录;接下来,经氯酸盐和草丁膦筛选成功获得了抗性藻株;最后,使用PCR-RESanger测序、高通量测序等多种分子检测方法,检出六种基于Indels突变的UpNR突变型。成功实现UpNR的基因编辑,标志着在浒苔中首次建立了基于CRISPR/Cas9的基因编辑方法。

    最后,我们解析了浒苔类胡萝卜素合成通路。克隆了浒苔八氢番茄红素合成酶基因(UpPSY)、八氢番茄红素脱氢酶基因(UpPDS)、ζ-胡萝卜素脱氢酶基因(UpZDS)和β-胡萝卜素环化酶基因(UpLCYb),分别解析了其基因结构。通过遗传互补实验分别验证了上述四个基因的功能。表达分析结果显示,在转录水平,UpPSYUpPDSUpZDS明显受光的诱导,受营养盐条件的变化影响不大;与之相反,UpLCYb基因受光诱导不明显,反而在营养缺陷条件下有较强表达。

    综上所述,本文克隆了首个大型绿藻氮代谢基因——UpNR,并以UpNR为靶基因,首次在大型海藻中实现了基于CRISPR/Cas9基因编辑。同时,首次在大型海藻中解析了类胡萝卜素合成通路,将为开展基于CRISPR/Cas9的基因敲除、单碱基编辑、基因表达调控等技术方法的应用评价提供重要的靶向位点。

语种中文
文献类型学位论文
条目标识符http://ir.qdio.ac.cn/handle/337002/154471
专题实验海洋生物学重点实验室
中国科学院海洋研究所
推荐引用方式
GB/T 7714
郭扬. 大型绿藻浒苔CRISPR/Cas9基因编辑技术的建立[D]. 中国科学院海洋研究所. 中国科学院大学,2018.
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