IOCAS-IR  > 实验海洋生物学重点实验室
卡帕藻和麒麟菜光合和抗氧化系统对温度胁迫的响应
李虎
学位类型博士
导师刘建国
2017-04-28
学位授予单位中国科学院大学
学位授予地点北京
学位专业海洋生物学
关键词卡帕藻和麒麟菜 愈伤组织 温度胁迫 抗氧化系统 光合系统
摘要卡拉胶作为一种安全的食品添加剂,具有凝胶、增稠和保水特性,是食品加工行业的重要原料。热带海域生长繁殖的大型藻类——长心卡帕藻(Kappaphycus alvarezii)、异枝卡帕藻(Kappaphycus striatum)和细齿麒麟菜(Eucheuma denticulatum)是重要的产卡拉胶海藻,具有极高应用与经济开发价值。本研究以上述海藻为对象,1)探讨了长心卡帕藻原生质体分离方法,研究纤维素酶、果胶酶和蜗牛酶等破壁酶对藻细胞的破壁效果,随后利用融合剂——聚乙二醇(PEG-4000)进行细胞融合实验进而成功地实现了原生质体融合;2)利用不同配比的植物生长调剂(植物生长素、细胞分裂素等)、光强梯度以及不同PES培养基类型(固体和液体),通过长心卡帕藻组织培养,研究并优化了该藻新芽形成和愈伤组织诱导发生的条件;显微跟踪观察了该藻愈伤组织形态建成过程,同时,探究了愈伤组织形态建成和新芽形成过程中其光合与呼吸发生的变化;3)以26°C为对照温度,研究了在系列梯度低温(23°C、20°C、17°C和14°C)和高温(29°C、32°C和35°C)下,长心卡帕藻、异枝卡帕藻和细齿麒麟菜(红色和绿色藻株)的各种抗氧化物酶(SOD、GPX、APX、CAT、POD等)酶活性和抗氧化相关物质(H2O2、GSH、GSSG、MDA等)含量变化,并探讨了其抗氧化系统的响应机制;分析测定了温度胁迫下,上述海藻的光合与呼吸速率,光化学效率,PSII天线端、反应中心、电子供体侧、电子受体侧等光系统关键部位的变化;比较研究了两种卡帕藻,红、绿两株细齿麒麟菜对低温(或高温)耐受性的差异。获得的主要结果如下:
1、成功获得了长心卡帕藻原生质体,发现蜗牛酶比纤维素酶和果胶酶有更高的细胞破壁效率。但该藻原生质体产率相对较低,原生质体浓度可维持在103-104个/mL,尚难达到细胞融合所需的106-107个/mL细胞浓度。经过初步离心浓缩,原生质体浓度可达到105个/mL,随后用PEG-4000化学法进行细胞融合,可成功观察到原生质体融合现象,但总体融合效率尚有待进一步提高。
2、在长心卡帕藻愈伤组织诱导过程中,发现适宜的添加蔗糖、6-BA,使用固体培养基对愈伤组织诱导具有重要作用,其中用“0.5 g/L蔗糖、光强54 μmol/m-2·s-1、PES固体培养基(0.8%琼脂)、2 mg/L 6-BA、未加植物生长素”的组合能够更有效地诱导该藻愈伤组织形成;该藻愈伤组织为瘤状的致密细胞团,由不含色素的细长状细胞组成;通过跟踪显微观察该藻愈伤组织形态建成过程,发现其来源于藻髓部小细胞,同时发现形成愈伤组织的藻枝段比形成新芽的藻枝段有较高的光合和呼吸速率,表明产生愈伤组织时的藻枝段细胞会有较高的生理活动与代谢。
3.(1)在轻度低温(20°C和23°C)或高温(29°C和32°C)胁迫下,卡帕藻和麒麟菜通过提高抗氧化系统SOD、POD、APX、GPX等几种重要抗氧化物酶的活性、羟自由基去除能力和抗氧化物质GSH的含量以适应温度胁迫,但是在重度低温(14°C)或高温(35°C)下,上述抗氧化酶活性下降、抗氧化物质含量降低,藻体抗氧化系统受到严重损伤,藻机体不能抵御上述胁迫。
(2)长心卡帕藻光系统能耐受20°C和23°C低温,异枝卡帕藻仅能耐受23°C低温,但温度在20°C以下时两者皆不能忍受,表明长心卡帕藻比异枝卡帕藻有较强的低温耐受性。相比而言,在适度低温20°C和23°C时,绿色细齿麒麟菜光系统效率有所降低,而红色细齿麒麟菜却未受影响,推测细齿麒麟菜的红色藻株比绿色藻株有更强的低温耐受性。
(3)上述藻的PSII天线端、反应中心和电子受体侧对低温敏感性不同:长心卡帕藻PSII天线端比反应中心和电子受体侧对低温敏感,异枝卡帕藻PSII天线端和反应中心比电子受体侧对低温敏感;红色细齿麒麟菜PSII天线端比反应中心和电子受体侧对低温敏感,绿色细齿麒麟菜PSII反应中心和电子受体侧比天线端对低温敏感。
(4)最新发现低温胁迫下长心卡帕藻光系统一种可能的受伤机理:低温胁迫通过降低Rubisco LSU的表达量影响光系统暗反应的卡尔文循环(Calvin cycle),使得还原力(如NADPH)增多,光合电子传递链中存在过多剩余电子,从而引起ROS增多。ROS反过来进一步影响基因psbA的翻译,导致D1蛋白前体合成受阻,D1蛋白表达量减少,直接造成PSII修复过程无法完成。正常情况下,PSII损伤和PSII修复过程处于动态平衡,而PSII修复过程无法进行,使得PSII的损伤加重,导致了光系统损伤。
(5)虽然长心卡帕藻和异枝卡帕藻光系统都能耐受29°C和32°C高温,但长心卡帕藻在35°C下光系统遭到严重破坏,而异枝卡帕藻光系统却未出现严重损伤,推测异枝卡帕藻比长心卡帕藻有较强的高温耐受性。另外,高温29°C和32°C使得红色和绿色两株细齿麒麟菜光合效率都有所增加,说明适度高温可提高藻光合效率;但35°C高温会导致红色细齿麒麟菜光合系统受损伤,相比而言,绿色细齿麒麟菜能忍受35°C高温,表明绿色细齿麒麟菜比红色细齿麒麟菜有较强的高温忍耐性。
(6)长心卡帕藻PSII天线端、反应中心和电子受体侧能承受29°C和32°C的高温,但在35°C高温时上述光合部位受到严重损伤,而异枝卡帕藻的PSII天线端的光吸收效率、反应中心效率和电子受体接受电子效率在所有梯度高温下都未有显著性下降,再次证明异枝卡帕藻比长心卡帕藻有较强的高温耐受性;在35°C高温下,红色细齿麒麟菜反应中心效率未受显著影响,但天线端光吸收效率和电子受体接受电子效率降低,也说明不同光系统部位对高温忍耐性不同。
其他摘要The tropical marine seaweeds Kappaphycus alvarezii (Rhodophyta, Solieriaceae), Kappaphycus striatum, Eucheuma denticulatum, some important carrageennophytes in food industry, was used for the major commercial source of carrageenan, which is widely used as gelling and stabilizing agent for the preparation of some edible products. These carrageenan-producing seaweeds are taken as research objects and the research is focus on that 1) Isolation of protoplasts from K. alvarezii thalli was studied by different commercial enzymes (cellulase, pectinase and snailase), and protoplast fusions were made by treatment with polyethylene glycol (PEG-4000) solution;2) Effects of phytoregulators (Indole-3-acetic acid, Indole-3-butyric acid and 6-benzylaminopurine), light intensity and the culture media (with or without gelling agent) were tested on callus formation in K. alvarezii thalli; 3) The variations of photosynthetic rate, respiratory rate and photosystem apparatuses (the antenna side, reaction center, electron donor side and electron accept side in PSII), and responses of antioxidant system (the variations of antioxidant enzymes - superoxide dismutase (SOD), hydroperoxide dehydratase (CAT), ascorbate peroxidase (APX), peroxidase (POD) and glutathione peroxidase (GPX) activities, hydroxyl free radical scavenging capacity (HFRSC), the low-molecular weight compounds - reduced glutathione (GSH) level and malonaldehyde (MDA) level) of K. alvarezii, K. striatum and E. denticulatumt (red and green strains) thalli under control temperature (26°C), low temperatures (23°C, 20°C, 17°C and 14°C) and high temperatures (29°C, 32°C and 35°C) were studied. The main results of this study are as follows:
1. K. alvarezii protoplasts were isolated successfully, but the protoplasts concentration is only 103-104/mL. It was found that the breaking efficiency of snailase was better than that of cellulase and pectase. After protoplasts were concentrated to 105/mL (centrifugation), protoplast fusions were made by treatment with polyethylene glycol (PEG-4000) solution. Though fusion cells were harvested successfully, the cell fusion efficiency is low relatively.
2. The callus of K. alvarezii was achieved successfully by the combination of 0.5g/L saccharose, light intensity 54 μmol/m-2·s-1, PES liqiud medium (0.8% agar), 2 mg/L 6-BA without IBA. K. alvarezii callus which consisted of compact filamentous cells derived from the medullary cells of seaweed thalli. It was found that both photosynthetic rate and respiratory rate in the branch inducing callus were higher than ones of the branch germinating new bud by means of oxygen electrode, indicating that the branch which induced callus had higher physiology activity.
3. (1) Antioxidant enzymes (e.g. SOD, POD, APX, GPX) activity and antioxidant substance level (GSH) increased in low temperatures 23°C and 20°C, or high temperatures 29°C and 32°C in Kappaphycus or Eucheuma. But antioxidant enzymes activity and antioxidant substance level decreased deeply in these seaweeds under low temperature 14°C or high temperature 35°C, indicating that their antioxidant systems were damaged and these seaweeds were unable to resist the mentioned temperature stress (14°C or 35°C).
(2) K. alvarezii has good low temperature resistance than K. striatum (The photosystem of K. alvarezii can resist the low temperature 23°C and 20°C, while that of K. striatum can only resist the low temperature 23°C; two seaweeds were unable to resist below 20°C). Green E. denticulatum was more sensitive to low temperature stress than red E. denticulatum. At low temperature 23°C and 20°C, photosynthetic efficiency of green E. denticulatum decreased significantly while that of red E. denticulatum had no change, indicating that red E. denticulatum has good low temperature resistance than green E. denticulatum.
(3) The antenna side, reaction center and electron accept side in PSII of the mentioned carrageenan-producing seaweeds have different low-temperature sensitivities: The antenna side is more sensitive to low temperature than the reaction center and electron accept side in PSII of K. alvarezii. The antenna side and reaction center are more sensitive to low temperature than the electron accept side in PSII of K. striatum. The antenna side is more sensitive to low temperature than the reaction center and electron accept side in PSII of red E. denticulatum. The reaction center and electron accept side are more sensitive to low temperature than the antenna side in PSII of green E. denticulatum.
(4) A possible scheme for inhibiting the photosystem in K. alvarezii thalli during low temperature stress is proposed. Low temperature stress may weaken the activity of the Calvin cycle (through a decrease of the Rubisco LSU level) and decrease the utilization of NADPH, with a resultant decline in the level of NADP+ (the decrease of final PSI electron acceptors). The decrease of NADP+ results in the transport of electrons from PSI to molecular oxygen, with a resultant generation of H2O2 (a main ROS) via O2. Excess H2O2 blocked the production of Pre-D1 protein (the precursor of D1 protein) by inhibiting psbA (the gene encoding Pre-D1 protein) mRNA translation. That, in turn, inhibited de novo D1 protein synthesis (the decrease of D1 protein level), further reducing the repair of PSII and resulting in more severe damage to PSII.
(5) Both K. alvarezii and K. striatum can resist high temperatures 29°C and 32°C. At 35°C, the photosystem of K. alvarezii was damaged seriously while that of K. striatum wasn’t, indicating that K. striatum has good high temperature resistance than K. alvarezii. At 29°C and 32°C, red and green E. denticulatum increased their photosynthetic efficiencies, indicating that the moderate high-temperature can lead the increase of photosynthetic efficiencies in E. denticulatum thalli. However, the high temperature 35°C leads to the damage to the photosystem in red E. denticulatum, while green E. denticulatum can resist the same temperature. The result indicates that red E. denticulatum has poor high temperature resistance than green E. denticulatum.
(6) The antenna side, reaction center and electron accept side in PSII of K. alvarezii could resist the high temperature 29°C and 32°C. Light absorption efficiency of the antenna side, reaction center efficiency and accepting electron efficiency of electron accept side in PSII of K. alvarezii have significant decreases at high temperature 35°C while the mentioned efficiencies in PSII of K. striatum have no significant difference at the same temperature. This is again the proof that K. striatum has good high temperature resistance than K. alvarezii. At 35°C, light absorption efficiency of the antenna side and accepting electron efficiency of electron accept side have significant decreases while there is no significant decrease of reaction center efficiency in PSII of red E. denticulatum, indicating that the photosynthetic apparatuses in PSII have the different high-temperature resistance.
学科领域生理学 ; 植物学
语种中文
文献类型学位论文
条目标识符http://ir.qdio.ac.cn/handle/337002/136546
专题实验海洋生物学重点实验室
作者单位1.中国科学院海洋研究所
2.中国科学院大学
推荐引用方式
GB/T 7714
李虎. 卡帕藻和麒麟菜光合和抗氧化系统对温度胁迫的响应[D]. 北京. 中国科学院大学,2017.
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李虎博士毕业论文(2017.5月27, (4758KB)学位论文 开放获取CC BY-NC-SA请求全文
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