珍珠贝贝壳蛋白组学及胁迫环境下的应激调控网络

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	珍珠贝贝壳蛋白组学及胁迫环境下的应激调控网络
其他题名	珍珠贝
	黄荣莲1,2
学位类型	博士
导师	张国范
	2016-05
学位授予单位	中国科学院大学
学位授予地点	北京
学位专业	海洋生物学
关键词	合浦珠母贝蛋白质组生物矿化 Wgcna 环境胁迫
其他摘要	生物矿化（biomeralization）是指在生物有机大分子（主要是蛋白质、糖蛋白或多糖）调控下，在生物体特定部位有序沉积形成矿物晶体（生物矿物）的过程。软体动物的贝壳则是生物矿物典型的代表。由于珍珠贝（包括海水和淡水）可分泌形成质地坚硬、色彩斑斓、熠熠生辉的文石结晶层，而被利用于培育有核或无核珍珠。合浦珠母贝 Pinctada fucata martensii 是中国及日本等国家最主要的海水育珠贝，其所产珍珠史称“南珠” 。本研究基于合浦珠母贝全基因组序列全基因组序列精细图谱，通过检测和分析贝壳珍珠层与棱柱层的基质蛋白（家族），探讨贝壳结晶层的形成分子机制；并利用 WGCNA 的方法构建了贝壳蛋白在非生理条件下的应激网络。由于珍珠贝珍珠层与珍珠在物质组成、形成过程的相似性，该研究对于理解珍珠贝珍珠形成的机制及珍珠品质的改善也都有一定的借鉴意义。具体的研究结果如下： 1．合浦珠母贝贝壳蛋白组学研究基于合浦珠母贝全基因组序列精细图谱，本研究利用高效液相色谱串联质谱电喷雾检测技术(LC-ESI-MS/MS)分别获得棱柱层的酸不溶蛋白（PI）、可溶性蛋白（PS）、珍珠层不溶性蛋白（NI）和可溶性蛋白（NS）各 207、109、199 和 120 种，其中有 78 个为已知功能的。分别计算四组蛋白中含量最高的 20 种蛋白，结果发现四组样品共有的高含量基质蛋白为酪氨酸酶（Tyrosinase，Tyr）、类纤连蛋白（Fibronectin-like protein，FLP）和 N19。棱柱层与珍珠层基质蛋白含低复杂性区域（related low complexity domain, RLCD）蛋白，或称天然无序蛋白（intrinsically disordered proteins, IDP）。四个样品中，已报道的珍珠层基质蛋白均被检测到，但含量存在较大的差异，如 N19 和 nacrein 等。相同的情况也发生于已知棱柱层特有的蛋白，如 Tyr 和 FLP。结晶层基质蛋白编码基因的组织表达数据显示，多个组织都存在一定的贡献率，而非传统的认识外套膜不同分区特异表达确定其结晶层特有蛋白。不同的结晶层虽然有其特有的基质蛋白，但含量较高的功能基质蛋白，一般同时存于两种结晶层，基质蛋白的水平差异可能是选择不同结晶形态的主要因素。另外，在基因组数据基础上，比较三种贝类(Pinctada fucata martensii、 Lottia gigantea 和 Crassostrea gigas)的贝壳基质蛋白，结果显示，单拷贝基因家族中的碳酸酐酶（carbonic anhydrase，CA）在贝壳中已经分化出新的功能基因（nacrein）。 Tyr 家族有些成员在三个物种中都能找到同源基因，且在合浦珠母贝中为多拷贝基因，而部分成员则仅在长牡蛎中找到同源基因，说明 Tyr 在序列上已经发生明显分化，这与贝类 Tyr 家族进化分析的结果相吻合。多种 ECM 在贝壳中含量丰富，暗示 ECM 在贝壳矿化中起重要的作用。 2．贝壳基质蛋白（家族）序列分析、同源建模与功能预测对贝壳蛋白中重要的基质蛋白（家族）Tyr、FLP 和 IDPs 进行了序列和功能分析。分别克隆获得 2 个合浦珠母贝和 10 个长牡蛎 Tyr 家族成员的全长。本研究主要关注合浦珠母贝和长牡蛎贝壳中的 Tyr 成员，其序列特征以及含量分析显示， Tyr 的 pI 值可能对其在贝壳中的功能有重要的相关性。对贝类及其他物种已知的 Tyr 家族进行进化分析，结果显示合浦珠母贝和长牡蛎 Tyr 都单独进化成一支，进一步表明两个物种以及物种内功能可能已经发生了分化。同源建模后获得催化活性中心关键氨基酸具体的位置信息，并分析其与酶活性之间的关系。合浦珠母贝的 FLPs 序列与结构分析结果显示，含 4 个 FNIII 结构域，内含氨基酸重复差异较大，二级结构显示都可形成典型的 β 折叠，但都缺乏重要的与细胞结合的功能结构域 RGD，暗示着与细胞结合的功能的缺少。单个 FNIII 结构域的进化分析显示，贝壳 FLPs 中 FNIII 与高等动物的酪氨酸磷酸酯酶(Protein tyrosine phosphatase, PTP)具有较高的同源性，暗示着可能存在相似的功能。合浦珠母贝贝壳中的 IDPs 在四个样品中种类以及丰度占较大的比例。在全基因组水平上，对比 3 个贝类物种合浦珠母贝、长牡蛎和帽贝贝壳中 IDPs 占所有贝壳基质蛋白的比例，平均比例分别为 28.53%，15.55%和 26.64%。发现在 3 个物种的特有贝壳基质蛋白含量较平均水平高，分别为 34.23%、18.52%和 34.62%。合浦珠母贝的多拷贝直系同源中含量也达到了 33.33%，主要原因为细胞外基质（ECM）的组分较多。通过比对发现珠母贝属珍珠层和棱柱层 IDPs 同源性极高，如珍珠层基质蛋白 MRMP34, NUSP1/2/5/7/8/9 和棱柱层 PUSP2/8/10。通过网上 IDP 比对工具，发现 pearlin（N16）、nacrien 和 MSI60 都含有鲍珍珠层特有基质蛋白 AP7 结晶结合位点基序 DDNGN。因此推断文石晶体成核的功能基因通过成核基序（motif）维持其保守性，并以模块化形式发挥作用。 3．采用共表达网络分析法（WGCNA）构建合浦珠母贝高温、酸化胁迫下的应激调控网络从 NCBI 网站 CEO 数据库中，获取在高温和海水酸化胁迫下合浦珠母贝外套膜基因表达数据。利用共表达网络分析法（WGCNA）筛选出在上述胁迫下影响显著的基因模块，并对模块中包含的基因进行功能富集；同时将贝壳蛋白在各个模块的分布情况进行统计，并分析贝壳蛋白与 hub-gene 的关联性，构建矿化基因的应激网络。结果表明，高温显著响应模块基因富集结果显示细胞骨架蛋白基因，如 ARHGEF4、SAP 和 myosin 都发生了显著的变化，而这些基因主要与细胞迁移关系密切。另外，该模块中受影响的信号通路基因较多，包含热激蛋白，主要受影响的基因是膜受体蛋白，说明细胞对温度应答较复杂。酸化应答模块共 5 个，响应的基因包括呼吸相关的血红素 A 合成酶、芳香族氨基酸代谢相关的酶、钙粘蛋白和血小板反应蛋白等。同时，本研究关注的矿化基因也在高温应答模块中富集，其中包括 Tyr、FLP 等重要的矿化基因，说明这些矿化基因对温度较为敏感。为研究这些矿化基因与其他基因的关联性，本研究构建了基因共表达网络，结果显示钙离子结合蛋白、细胞骨架蛋白、蛋白质糖基化相关的基因关系密切。在实验室模拟海洋酸化条件下，测定了 3 个珍珠层基质蛋白编码功能基因的表达量变化以及贝壳晶体形貌的变化，结果显示这些基因的表达受不同程度的影响，珍珠层也出现非正常晶体形貌特征。 ; Biomineralization refers to an orderly deposition of mineral crystals (biological minerals) internal of the organism under the control of bio-organic molecules (primarily proteins, glycoproteins or polysaccharides). Molluscan shell is a typical representative of biological minerals produced by mollusk species. Pinctada fucata martensii is a major sea pearl shell in China as well as in Japan. To uphold the quality and market value of the pearl, we detected and analyzed of matrix protein (or protein family) contained in the prismatic and nacreous layer of shell based on fine pearl oyster genome. Meanwhile, we screen significantly response gene module(s) and construct a biomineralization-related gene network under non-physiological conditions by using WGCNA. Specific contents are as follows: 1. Shell proteomics in Pinctada fucata martensii By using LC-ESI-MS/MS, we identified acid insoluble ( PI) and soluble proteins (PS) in prismatic layer, nacre insoluble (NI) and soluble protein (NS) respectively, as 207,109,199 and 120 in number . Of the total 366 proteins, 78 are known functional proteins. The proteins content of top 20 in the 4 samples were calculated. T yrosinase (Tyr), fibronectin like protein (FLP) and nacre protein N19 are found in all samples. Related low complexity domain (RLCD) proteins, also known as intrinsically disordered proteins (IDPs), are high level in nacre and prism layer. The nacre matrix proteins such as the N19, nacrein were identified in all four samples, but the levels were difference. The same situation also occurs in the prismatic matrix protein, such as Tyr, FLP . In combined with the gene expression data, the conclusion of multi-tissue contribution to crystal specific gene expression is in contradict with the traditional understanding of the mantle regions for different partitions. Finally, we compared shell matrix proteins of three molluscan species. Novel function gene nacrein derived from ancient carbonic anhydrase was detected in all species. Multi-copy genes include Tyr family and ECM coding genes which indicate their important roles in shell biomineralization. 2. Shell protein (family) sequence analysis, homology modeling and functional prediction in Pinctada fucata martensii Clone whole length cDNA 10 Crassostrea gigas Tyrs and 2 P. fucata martensii Tyrs. This study focuses on those Tyr family with high abundance in shell which indicate pI may be related to its biomineralization function. Phylogenetic analysis indicates function differentiation may have occurred. Homology modeling structure of Tyr located the key amino acid in the catalytic center, and their relation with the Tyr functions and. Another high level matrix protein family are FLPs with 4 tandem FNIII domains. These FNIII domains contain different amino acid repeat but were lack of important functional domains RGD found in mammal. Phylogenetic analysis indicate the FNIII in FLPs were homologous to those in protein tyrosine phosphatase (PTP) of high animals. Sequence and structure analysis FNIII family show the, revealing its function conversion. IDPs are abundance in four samples. On the genome level, IDPs proportions of total protein shell in three molluscan species were 28.53% in P. fucata martensii, 15.55% L. gigantea and 26.64% in C.gigas. Species matrix proteins are relative higher proportion of IDPs with 34.23%、18.52%和 34.62% respectively. Two types of IDPs were classified by length of the conserved region. One is including those that are highly homologous in full length of sequences, such as nacre matrix protein MRMP34, NUSP1 /2/5/7/8/9 and the prismatic matrix protein PUSP2 /8/10. The other are those contain conserved motifs such as pearlin (N16), nacrien, MSI60, which contain crystal nuclear site motif DDNGN of abalone nacre crystalline matrix protein AP7. Conservative motifs in nonhomologous aragonite matrix proteins represent a common type of modular function. 3. The network construction for high temperature and ocean acidification stress in pearl oyster by co-expression network analysis (WGCNA) Gene expression data of pearl oyster under high temperatures and seawater acidification stress from NCBI website CEO database were analyzed by WGCNA. One gene module of heat stress and five modules were screened. GO enrichment of those modules indicates those functional genes cluster response to environmental factor. Cytoskeletal proteins such as ARHGEF4, SAP and myosin were associated to temperature stress. Acidification transponder modules recruit heme A synthase, aromatic amino acid metabolism-related enzyme, cadherin and platelet-reactive protein. We also focus on signaling pathways in those modules, including the heat shock pathway. Among these signaling pathways, membrane receptors are sensitive. Interestingly , the high stress module enriched the most mineralization genes, including Tyrs and FLPs. To reveal the relation between the mineralization genes and other function genes, we constructed the gene co-expression network, showed that calcium-binding proteins, cytoskeletal proteins and protein glycosylation genes closely related. Simulated the condition of ocean acidification ,we observed changes in nacre crystal morphology and examined the expression levels of nacre mineralization associated genes (pif177, nacrein and pearlin) in the mantle pallial zone.
学科领域	海洋生物学 ; 分子生物学
语种	中文
文献类型	学位论文
条目标识符	http://ir.qdio.ac.cn/handle/337002/117012
专题	实验海洋生物学重点实验室
作者单位	1.中国科学院大学 2.中国科学院海洋研究所
第一作者单位	中国科学院海洋研究所
推荐引用方式 GB/T 7714	黄荣莲. 珍珠贝贝壳蛋白组学及胁迫环境下的应激调控网络[D]. 北京. 中国科学院大学,2016.

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珍珠贝贝壳蛋白组学及胁迫环境下的应激调控（7073KB）	学位论文		限制开放	CC BY-NC-SA	浏览